载5—氟脲嘧啶纳米纤维膜的制备及其对肝癌细胞抑制作用的研究

万娜 刘志强 陈志龙

【摘要】研究化疗药物5-氟脲嘧啶（5-FU）的聚乳酸（PLLA）纳米纤维膜的制备及其对肝癌细胞的体外抑制效果。采用静电纺丝方法制备载5-FU纳米纤维膜。通过扫描电镜（SEM）观察其形貌。采用噻唑蓝（MTT）比色法，检测纳米纤维膜对肝癌细胞SMMC-7721的体外杀伤效果。结果表明：由SEM可以看出5-FU能够均匀分布在纳米纤维药膜中， MTT检测载5-FU纳米纤维膜对SMMC-7721有杀伤作用。

【关键词】5-氟脲嘧啶；纳米纤维膜；抗肿瘤；肝癌

原发性肝癌是全球常见的恶性肿瘤之一，2000年全球因肝癌死亡者高达54.86万人，5-氟脲嘧啶（5-FU）是在化疗中应用广泛且疗效确切的化疗药物。近些年来，随着科学技术的不断发展，静电纺丝受到了越来越多的关注。同时，基于电纺纳米纤维作为给药系统的研究也越来越引起人们的注意，用电纺纳米聚合物纤维作为给药系统具有一定的优势。本文以抗癌化疗药物5-FU作为模型药物，以聚乳酸（PLLA）作为药物的载体高分子材料，采用静电纺丝技术制备了抗癌药物/PLLA载药纳米纤维膜，对此类药物临床新剂型的开发应用做出初步探索。

1 材料和方法

1.1 主要材料和仪器

采用静电纺丝技术制备载药量分别为1%，3%和5%的5-FU/PLLA纳米纤维膜，5-FU由本实验室自制；人肝癌细胞株SMMC-7721购买自上海中科院生物细胞库；氯仿（上海化学试剂有限公司）；丙酮（中国上海试剂总厂）；乙酸（国药集团化学试剂有限公司）；聚乳酸（PLLA）（济南岱罡生物科技有限公司）； MTT（Sigma公司）；RPMI1640培养液（吉诺生物有限公司）；扫描电子显微镜（SEM，上海光学仪器厂）；酶标仪（Thermo Fisher Scientific）。

1.2 实验方法

1.2.1 溶液的配制

称量好一定量的聚乳酸PLLA溶于氯仿和醋酸的混合溶液中，放在恒温（室温）磁力搅拌约2-3小时，以得到均匀的溶液。同时称取一定量的化疗药物5-FU倒入上述混合溶液中，搅拌使其与PLLA溶液充分混合以制备均匀的溶液。最后在电纺前加入一定量的丙酮溶剂，继续搅拌大约20-30分钟。

1.2.2 静电纺丝

将注有纺丝液的5ml注射器固定在微量注射泵上，调节枕头（针头口径为0.7mm）与接收铝箔的距离为13cm，阳极与针头相连，阴极连接铝箔，并将微量注射泵的流量设定为0，8ml/h，电压设置为16kV，纺丝液在高电场的作用下形成符合纳米纤维，电纺纤维以无纺膜的形式收集在接收铝箔上。

1.3 纳米纤维微观形貌的观察

将制成的样品放入真空干燥箱干燥后，用扫描电镜SEM观察其微观形貌。

1.4 5-FU/PLLA纳米纤维膜的细胞抑制实验

1.4.1 细胞培养

肝癌细胞SMMC-7721培养于含10%胎牛血清的RPMI1640培养基中。在含5%CO2，37℃培养箱中孵育。隔天换液，细胞铁壁密度达80%左右传代。

1.4.2 实验分组

共分为4组，纯膜组为不含5-FU的PLLA纳米纤维膜，实验组分别为载药量为1%，3%和5%的5-FU/PLLA载药纳米纤维膜。

1.4.3 MTT测定SMMC-7721细胞的抑制率

将纳米纤维膜制成直径为1cm的圆形薄片，放入24孔板中。加入高浓度双抗浸泡后再用RPMI1640培养液浸泡漂洗，干燥后以备细胞培养。取SMMC-7721细胞悬液加入24孔板（3×104/孔），5%CO2，37℃培养箱中孵育过夜后弃去原液，每孔加入10%MTT溶液的培养液，继续于37℃，5%CO2孵箱中培养4h。终止培养，小心吸取孔内培养的上清液，每孔加入DMSO，行MTT检测（检测波长为490nm），并计算细胞存活率。

2 结果与分析

2.1 纤维形貌观察

图1是同一纺丝工艺下，静电纺PLLA和载药PLLA纳米纤维膜的扫描电镜图片。从图中可以看出，在浓度为5%PLLA体系中，当药物的浓度为1%，3%时纤维的产量较高，纳米纤维没有珠节存在，成形较好，且分布比较均匀。当5-氟脲嘧啶的浓度为5%时，这时的静电纺丝效果不佳，在纤维的表面可以很明显的看到珠串现象以及纤维之间出现了黏连和分支现象。

图1 SEM观察结果。（a）纯PLLA；（b）1% 5-FU；（c）3% 5-FU；（d）5% 5-FU。

2.4 载5-FU纳米纤维膜对SMMC-7721细胞的抑制作用

根据实验结果可知，随着纳米纤维膜中5-FU的含量增加，纳米纤维膜对细胞的抑制作用也逐渐增强。当载药量为1%时，对细胞的抑制率为32.41%；当载药量增加到3%时，对细胞的抑制率增加到61.4%；当载药量为5%时，此时对细胞的抑制率高达89.90%。说明随着药物的含量增加，该纳米纤维膜对SMMC-7721的殺伤作用有逐渐增强的趋势。而不含5-FU的纯PLLA纳米纤维膜则基本没有细胞抑制作用，其细胞抑制率仅为4.62%。

3 结论

（1）通过静电纺丝技术制备了载5-氟脲嘧啶的纳米纤维膜，以几乎不溶于水的化疗药物为药物模型，制备了一种抗癌药物新剂型，改善了由于传统给药方式对患者所造成的伤害以及药物的毒副作用和提高了药物的生物利用率等。

（2）通过扫描电镜SEM观察到载药电纺纤维膜形态均匀。加入药物后对静电纺丝形态没有影响，药物在PLLA纳米纤维中均匀分布。

（3）通过对载药纳米纤维膜的细胞水平的评价可知，载药纤维膜对肿瘤细胞SMMC7721有抑制的作用，可以作为抗癌药物的新剂型用于后期的实验研究。