龙葵果提取物抗氧化活性测定及酚类活性成分分析

腾飞 袁长鹏 王萍

(东北林业大学林学院，黑龙江哈尔滨 150040)お

摘要

［目的］比较不同龙葵果提取物的抗氧化活性，同时测定其活性成分。［方法］用浓度60%乙醇浸提龙葵果，获得粗提物，减压蒸馏后分别用正丁醇、乙酸乙酯、氯仿3种溶剂萃取，采用DPPH·、·OH，O2-·清除法对各提取物的抗氧化作用进行评价，并与浓度60%乙醇粗提物溶液进行比较；分别测定4种龙葵果提取物中酚酸、黄酮、原花青素和花色苷的含量。［结果］浓度60%乙醇粗提物对DPPH·和·OH的清除效果最好，清除率分别为（68.45%±2.68%）和（49.12%±2.26%）；乙酸乙酯萃取物对O2-·的清除率最大为（79.64%±5.16%）。浓度60%乙醇粗提物中花色苷浓度为3.65 mg/ml，而乙酸乙酯萃取物中含有高浓度黄酮，浓度为3.42 mg/ml。［结论］龙葵果提取物中起主要抗氧化作用的是花色苷和黄酮。

关键词 龙葵(玈olanum nigrum L.)；抗氧化；花色苷；黄酮

中图分类号 SB567文献标识码 A文章编号 0517-6611（2014）19-06217-03

Study on Antioxidant Activity of Extracts from 玈olanum nigrum 獿. Berries and Analysis of the Active Ingredients

TENG Fei, WANG Ping et al

(Forestry School, Northeast Forestry Univer Sity, Harbin, Heilongjiang 150040)

Abstract ［Objective］ The antioxidant activity of the different extracts from 玈olanum nigrum 獿. berries was compared and the active ingredients were determined. ［Method］The 玈olanum nigrum 獿. berries were extracted by 60% ethanol. Then 60% ethanol extracts were extracted by n瞓utanol, ethyl acetate and chloroform, respectively. DPPH free radicals, hydroxyl free radicals and superoxide radicals scavenging assays were investigated. In order to determine phenolic acid, flavonoids, proanthocyanidin and anthocyanins, the method of gallic acid, rutin colorimetric, hydrochloric acid瞯anillin and pH瞕ifferential spectrophotometry were applied in this work.［Results］ Ethanol extract had the highest DPPH free radicals and hydroxyl free radicals scavenging activity (scavenging activities of 68.45%±2.68% and 49.12±2.26%, respectively). The ethyl acetate extracts had the highest superoxide radicals scavenging activity (79.64%±5.16%). Ethyl acetate extract contained the highest concentration of flavonoids, while 60% ethanol extract contained the highest concentration of anthocyanins. ［Conclusion］This showed that anthocyanins and flavonoids had a positive effect against oxidative.

Key words 玈olanum nigrum 獿.; Antioxidant activity; Anthocyanins; Flavonoids

お

基金项目 国家自然科学基金(31170510)。

作者简介

腾飞（1990-），女，内蒙古赤峰人，硕士研究生，研究方向：天然活性物质提取分离。*通讯作者，硕士生导师，从事天然活性物质研究。

收稿日期 20140603

龙葵(玈olanum nigrum.L)为茄科(Solanaceae)茄属(玈olanum)一年生草本植物，是一种古老的东方药用植物，被认为有很多生物活性。龙葵全株高90~140 cm，暗绿色叶片，白色短梗小花。龙葵果未成熟时为绿色，成熟时为紫黑色［1］。目前关于龙葵提取物的抗氧化活性研究已有少量报道，贤景春［2-3］等采用超声法提取少花龙葵多酚和黄酮，并且分别测定了龙葵多酚和黄酮对羟基自由基的清除能力。Sun［4］等研究了龙葵中脂质过氧化，抗氧化酶活性和游离脯氨酸和植物螯合肽的积累，并且与茄子进行了对比。Jeong［5］等报道了一种从龙葵中纯化的多肽对DNA氧化损伤的保护作用，结果表明多肽预防DNA氧化损伤的机制是通过阻断Fe2+和H2O2之间的反应来实现的，多肽对于化学预防的氧化癌变有积极的作用。笔者对不同龙葵果提取物进行体外抗氧化活性评价，并且测定其中4种酚类活性物质含量，以期为龙葵的精深加工提供理论依据。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1

研究对象。龙葵果，采自哈尔滨市郊，于4 ℃冰箱冷藏备用。

1.1.2

主要仪器。722型分光光度计，购自上海精密仪器有限公司；离心机（TDL40B瞁）和高速摇床，购自泰斯特有限公司；恒温干燥箱（DHG9240），购自一恒仪器；RE52A旋转蒸发仪和SHB3真空泵循环水系统，购自上海亚荣生化仪器厂；PHS26数显pH计，购自上海精密试验仪器有限公司。

1.1.3

主要试剂。DPPH、2餐蜒酹睤埠颂恰⒚皇匙铀岷吐丁购自Sigma公司。其他试剂均为国产分析纯，市售。

1.2 方法

1.2.1

龙葵果不同提取物的制备。参照文献［6］的方法，获得龙葵果粗提物。取龙葵果粗提物，平均分成4份，其中3份分别用正丁醇、乙酸乙酯、氯仿萃取，回收溶剂并冷冻干燥成粉末，分别得到正丁醇萃取物、乙酸乙酯萃取物、氯仿萃取物和粗提物（60%乙醇提取物）。

1.2.2

龙葵果不同提取物清除DPPH·能力测定。参照参考文献［7］的方法，不同龙葵果提取物配制成0.2~2.4 mg/ml浓度的样品溶液。根据公式（1）计算清除率：

清除率(%)=［獳┛瞻转-(A┭品-A┒哉摘)］/A┛瞻转×100（1）

其中：獳┛瞻转为不加样品溶液，用60%乙醇代替；獳┒哉摘为不加DPPH溶液，用无水乙醇代替。以样品浓度为横坐标，清除率为纵坐标，得受试样品浓度与DPPH·清除率关系曲线。

1.2.3

龙葵果提取物清除·OH能力测定。对·OH的清除作用采用生成硫代巴比妥酸法来测定，用2餐蜒酹睤埠颂亲鞯孜铮参考Suksomtip等方法［8］，利用公式（1）计算清除率。

1.2.4

龙葵果提取物清除O2-·能力测定。采用邻苯三酚自氧化法。参照文献［9］的方法利用公式（1）计算清除率。

1.2.5

龙葵果提取物中酚酸含量的测定。（1）线性关系的考察。酚酸的含量由没食子酸表示。参照文献［10］的方法，以没食子酸的含量(μg/ml)为横坐标，吸光值獳为纵坐标，绘制标准曲线，计算线性回归方程。（2）龙葵果提取物中酚酸含量的测定。精密移取一定浓度的龙葵果提取物溶液2.0 ml置于25 ml容量瓶中，加无水乙醇至5.0 ml，按照标准曲线方法测定吸光值，根据所得的线性回归方程计算样品中的酚酸含量。

1.2.6

龙葵果提取物中黄酮含量的测定。（1）线性关系的考察。黄酮的含量以芦丁为标准品。参照参考文献［11］的方法，以芦丁浓度獵(mg/ml)为横坐标，吸光值獳为纵坐标，绘制标准曲线，计算线性回归方程。（2）龙葵果提取物中黄酮含量的测定。取一定浓度的龙葵果提取物2.0 ml于25 ml具塞试管，加浓度60%乙醇补足至10.0 ml，按照标准曲线的方法测定吸光值，由标准曲线得对应浓度獵，可算得样品的总黄酮含量。

1.2.7

龙葵果提取物中原花青素含量的测定。（1）线性关系的考察。样品中原花青素含量使用香草醛-盐酸法，参照参考文献［12-13］的方法。测定标准系列溶液吸光值獳，绘制原花青素浓度与吸光值标准曲线，计算线性回归方程。（2）取少量的不同龙葵果提取物配制成一定浓度的甲醇溶液，取2.0 ml至25 ml容量瓶中，按照标准曲线的方法测定吸光值，用所得的原花青素标准曲线回归方程计算样品中原花青素含量。

1.2.8

龙葵果提取物中花色苷含量的测定。参照文献［14］的方法并稍微改动，配制一定浓度的龙葵果提取物溶液，分别移取配制好的龙葵果提取物溶液10.0 ml，用pH 1.0和4.5的缓冲溶液定容至100 ml。达平衡后（pH 1.0为50 min，pH 4.5为80 min）分别在510和700 nm处测定吸光值。

花色苷含量(mg/ml)=(獳/εL)×M璚×DF

（2）

式中：A为吸光度，A=(A510 nm pH1.0-獳700 nm pH1.0）-(獳510n m pH4.5-獳700 nm pH4.5)；ε为矢车菊3财咸烟擒盏南光系数，26 900；獶F为稀释因子；M璚为矢车菊素3财咸烟擒盏姆肿恿浚449.2；獿为光程，1.0 cm。

2结果与分析

2.1龙葵果提取物抗氧化作用比较

2.1.1

龙葵果提取物清除DPPH·能力比较。图1表明，龙葵果各提取物对DPPH·都表现出较强的清除能力，在浓度范围内呈良好的量效关系。整体而言，浓度60%乙醇提取物（粗提物）对DPPH·的清除能力高于其他3种萃取物，当质量浓度为2.4 mg/ml时清除率达到最大（68.45%±2.68%）。清除能力大小依次为：60%乙醇粗提物>正丁醇萃取物>乙酸乙酯萃取物>氯仿萃取物，其獻C50分别为1.58、1.75、2.78和6.95 mg/ml。其中，当浓度低于0.4 mg/ml时，正丁醇萃取物对DPPH·的清除率略高于粗提物和其他2种萃取物，但随着浓度的不断提高，60%乙醇提取物对DPPH·的清除率迅速升高，当浓度高于0.4 mg/ml时，乙醇提取物对DPPH·的清除作用明显优于其他3种萃取物。可以看出，在低浓度时，除60%乙醇提取物外，随着萃取剂极性的减弱，所得萃取物对DPPH·的清除能力逐渐减弱。

图1龙葵果提取物对DPPH·的清除作用

2.1.2

龙葵果提取物清除·OH能力比较。图2表明，龙葵果各提取物对·OH都表现出良好的清除能力，并在浓度范围内呈现良好的量效关系。对·OH的清除能力大小依次为：粗提物>乙酸乙酯萃取物>正丁醇萃取物>氯仿萃取物，其獻C50分别为2.78、7.30、28.55和94.01 mg/ml。但当浓度低于0.6 mg/ml时，乙酸乙酯萃取物对·OH的清除作用略优于乙醇粗提物、正丁醇和氯仿萃取物。随着浓度的提高，60%乙醇粗提物对·OH的清除作用明显升高，当浓度达到2.4 mg/ml时，对·OH的清除率达到（49.12%±2.26%)，然而乙酸乙酯、正丁醇、氯仿萃取物分别为(37.54%±1.53%)、(27.76%±1.83%)和(20.08%±1.18%)。

图2 龙葵果提取物对·OH的清除作用

2.1.3

龙葵果提取物对O2-·清除能力比较。图3表明，龙葵果各提取物均能明显地清除O2-·，在试验浓度范围内呈良好的量效关系。60%乙醇提取物（粗提物）和乙酸乙酯萃取物对O2-·的清除作用明显高于其他2种萃取物。当浓度为2.4 mg/ml时，乙酸乙酯萃取物和60%乙醇提取物对O2-·的清除作用达到（79.64%±5.16%）和（75.87%±5.2%）。而正丁醇萃取物对O2-·的清除作用明显低于其他3种提取物，当浓度达到1.6 mg/ml时，清除作用就达最大，为（37.54%±2.74%）。O2-·的清除能力大小依次为：粗提物=乙酸乙酯萃取物>氯仿萃取物>正丁醇萃取物，其獻C50分别为1.07、1.07、2.35和6.25 mg/ml。

图3 龙葵果提取物对O2- ·清除作用

2.2 龙葵果提取物酚类活性成分分析

计算得酚酸的标准曲线方程为：珁=0.048x+0.008，R2=0.998。黄酮标准曲线方程为：y=2.859x-0.010，R2=0.999。原花青素的标准曲线方程为：y=0.143x-0.002，R2=0.999。花色苷含量使用pH示差法计算即可。

由表1可知，龙葵果各提取物中均含有酚酸，但含量差异较大，由多到少依次为60%乙醇提取物>正丁醇萃取物>乙酸乙酯萃取物>氯仿萃取物。与提取剂极性强弱一致，表明酚酸易溶解在极性较强的溶剂中。龙葵果各提取物中均含有黄酮类物质，但其含量差异较大，由多到少依次为乙酸乙酯萃取物>氯仿萃取物>60%乙醇萃取物>正丁醇萃取物，表明黄酮类物质易溶解在极性中等的溶剂中。正丁醇、乙酸乙酯、60%乙醇提取物中均含有原花青素类物质，但其含量差异较大，含量由多到少依次为乙酸乙酯萃取物>60%乙醇萃取物>正丁醇萃取物。而氯仿萃取物中不含原花青素，表明原花青素类物质易溶解在极性溶剂中，而在弱极性溶剂中不溶解。与参考文献［15］对原花青素的描述“原花青素能很好地溶于丙酮、乙酸乙酯、乙醇，不溶于苯、氯仿、石油醚、庚烷等”一致。

在4种提取物中，仅60%乙醇和正丁醇提取物中含有花色苷。其中，60%乙醇提取物中花色苷含量最高，为3.65 mg/ml，而乙酸乙酯和氯仿提取物中不含花色苷，表明花色苷为强极性物质，易溶于强极性溶剂中。

お

表1 龙葵果提取物酚类活性成分分析

样品 酚酸う蘥/ml 黄酮う蘥/ml 原花青素う蘥/ml 花色苷う蘥/ml

正丁醇 7.02±0.23 290.15±1.15 2.25±0.11 841.67±3.22

乙酸乙酯 3.23±0.18 3 420.24±2.23 1.07±0.05 0

氯仿 0.91±0.09 1 230.16±2.24 0 0

60%乙醇 11.78±0.33 550.09±3.12 2.65±0.09 3 654.79±5.21

3结论与讨论

龙葵果含有大量的抗氧化活性成分，这对工业有重要意义，因为这些活性物质越来越多的被应用于化妆品和药品和食品等行业。试验结果表明，这些活性物质对DPPH·，·OH和O2-·有良好的清除能力。不同提取物所含有的成分不同，经测定龙葵果提取物中含量最多的为花色苷（60%乙醇粗提物），其次是黄酮（乙酸乙酯萃取物），而酚酸和原花青素的含量则相对较少。这说明龙葵果提取物中起主要抗氧化作用的是黄酮和花色苷。因此，龙葵果中含有的抗氧化剂作为功能性食品配料的发展潜力巨大。

参考文献

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