胡椒果与胡椒叶精油化学成分分析

张水平 谷风林 吴桂苹 王庆煌

摘 要 采用水蒸气蒸馏法提取胡椒鲜果、黑胡椒、白胡椒和胡椒叶中的精油，得率分别为1.46%、1.77%、2.30%和1.25%。对精油进行GC-MS分析，分别鉴定得到38、31、36和63种化学物质，δ-榄香烯、3-蒈烯、D-柠檬烯、α-古巴烯、石竹烯和律草烯在果与叶中含量均较高，其中叶中δ-榄香烯含量占38.54%；蒎烯、月桂烯、α-水芹烯和间伞花素在果中含量较高，而在叶中含量较低；甘香烯、α-荜澄茄油烯、β-榄香烯、α-古芸烯、β-古巴烯、α-蛇床烯、花柏烯、4-异亚丙烯-7-甲基-6-亚甲基-2-辛烯酸甲酯和桉油烯醇在叶中含量较高，而果中含量较低或没有。此外，采用电子鼻方法可有效区分胡椒粉和胡椒叶。

关键词 胡椒；胡椒叶；精油；GC-MS；电子鼻

中图分类号 TS207.3 文献标识码 A

胡椒（Piper nigrum L.）是胡椒科胡椒属多年生常绿藤本植物，是世界上重要的香辛料作物，是人们非常喜爱的调味品[1]。此外，胡椒也是印度传统医学广泛应用的香辛料药物之一[2]，具有治疗哮喘、慢性消化不良、结肠毒素、肥胖、鼻窦炎、充血、发烧[3]、骨端冷、疝气（痛）、胃病（尤指慢性）和腹泻等的作用[4]。在中医药里，它具有温中散寒、下气、消痰的功效[5]。

目前，人们除了把胡椒作为传统的香辛料外，还开发研制了胡椒精油等深加工产品，胡椒精油一般作为理疗保健用品，供熏香、按摩时使用[1]，而且价格较高。胡椒在世界香料作物中占有重要地位，是国际贸易总量较大的农产品之一，且长期以来，国际胡椒市场存在需求旺盛与供应不足的矛盾[6]。因此，如果人们能够从胡椒叶中提取所需精油来替代胡椒果精油，或许可减少胡椒果的需求。

目前对胡椒的挥发油成分有一些报道，但少有对胡椒果精油和胡椒叶精油的比较鉴定，在课题组前期胡椒抗氧化能力的比较时，发现胡椒叶的粉末也散发出胡椒粉气味。因此，本实验在同等实验条件下鉴定比较了海南产鲜胡椒、黑胡椒、白胡椒及胡椒叶的精油成分，为胡椒精油的医疗保健作用提供科学依据，同时采用电子鼻方法对不同的胡椒粉末进行评价，为海南胡椒的综合利用提供了理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料

胡椒鲜果、胡椒叶采摘于中国热带农业科学院香料饮料研究所基地，胡椒鲜果八、九成熟，冻藏于-25 ℃冰箱内；黑胡椒、白胡椒于中国热带农业科学院香料饮料研究所加工；无水硫酸钠购自广州化学试剂厂，正己烷购自广东光华科技股份有限公司；C8-C25正构烷烃标准品购自Dr. Ehrenstorfer Gmbh Germany。

真空冷冻干燥机FD-2购自北京博医康实验仪器有限公司；高速万能粉碎机QE-300 g购自浙江屹立工贸有限公司；电子调温电热套98-1-B型购自天津市泰斯特仪器有限公司；布鲁克 SCIONTM GC-MS系统 配有NIST 11 Library和MS Workstation 8工作站，购自美国布鲁克公司；Alpha M.O.S电子鼻分析系统配有6种金属氧化物电极和ALPHASOFT 12.0工作站，购自法国Alpha M.O.S公司。

1.2 方法

1.2.1 精油的制备 胡椒鲜果与胡椒叶均真空冷冻干燥，黑胡椒和白胡椒采用40 ℃热风干燥24 h，将4种样品粉碎，过60目筛待用。参考GB/T 17527-2009提取胡椒精油，称取约40 g粉末加入1 000 mL圆底烧瓶中，加入防爆沸玻璃珠；然后加入400 mL蒸馏水，自来水回流，保持5滴/min的蒸馏速度；4 h后，待冷却到室温，读取精油体积；最后收集精油，加入无水硫酸钠4 ℃静置过夜，保存待用。本实验中胡椒鲜果用F表示，黑胡椒用B表示，白胡椒用W表示，胡椒叶用L表示。

1.2.2 GC-MS分析 参考Kapoor等[7]的方法，并作稍微改动。精油样品用正己烷稀释100倍，过0.45微孔膜，液体进样。进样口温度250 ℃，流量1.0 mL/min，进样量1 μL，分流比40 ∶ 1；升温程序：60 ℃保持1 min，以1.5 ℃/min升温到185 ℃，保留1 min，再以9 ℃/min升温到275 ℃，保持2 min。溶剂延迟3 min。全扫描：质荷比40-400。正构烷烃采用相同方法进样。色谱柱型号：BR-5 ms 30 meter，0.25 mm ID，0.25 μm df。

1.2.3 电子鼻分析 称取胡椒果与胡椒叶粉末0.20 g装入10 mL的顶空瓶中，样品重复6次，孵化器温度70 ℃[8]，孵化时间300 s，进样针温度80 ℃，进样量1 000 μL，获取时间120 s，延迟时间210 s。采用判别因子分析法（DFA）分析数据。

1.2.4 保留指数计算 保留指数Retention index（RI）采用C8-C25的系列正构烷烃计算而来。其概念是由Kovats[9]在1958年提出，是把组分的保留值用2个分别前后靠近它的正构烷烃来标定，正构烷烃的RI与所用色谱柱，柱温及其它操作条件无关。1963年van den Dool等[10]引入线性程序升温保留指数的概念，公式如下：

RI=100z+100[TR（x）-TR（z）]/[TR（z+1）-TR（z）]

式中：TR（x）、 TR（z）、 TR（z+1）分别代表组分、 碳数为z及z+1正构烷的保留温度，且TR（z）< TR（x）

当GC-MS的结果给出匹配度都非常高的2种以上的物质时，实验者就会对物质难以确定，这时就可以参考文献中已有物质的保留指数，如果未知物质的保留指数与参考文献中的相关物质保留指数相差较少，则二者可能是同一种物质，这样可以增加对未知物质的鉴定准确度。

1.3 数据分析

实验数据用Excel、Origin、SAS软件及仪器自带软件处理，差异显著性水平<0.05，平均数之间的比较采用极差检验。

2 结果与分析

2.1 精油得率

相关研究中胡椒精油的得率情况见表1。本实验中，黑胡椒精油得率为1.77%（以mL/g进行换算），呈蓝绿色；白胡椒精油得率为2.3%，呈浅绿色；鲜胡椒精油得率为1.46%，呈淡绿色；胡椒叶精油得率为1.25%，呈绿色。由表1可知，胡椒叶和胡椒鲜果的精油得率比黑胡椒和白胡椒的精油得率低。

2.2 GC-MS结果分析

对水蒸气蒸馏所得的4种精油样品进行GC-MS分析，总离子图见图1。由图1可知，胡椒果与胡椒叶的精油成分的种类和含量差别较大，但胡椒果产品之间的差别不明显。

采用背景扣除、 自动积分（Peak Width ： 4.0sec， Slope Sensitivity： 5， Tangent%： 10， Peak Size Reject： 1 000）和面积归一化法计算精油各组分的相对含量。对各峰质谱图进行NIST谱库检索（Max Rre-Search Hits： 6 000， Max Final Search Hits ： 100， 阈值： 500）和人工谱图解析，数据库有MAINLIB、REPLIB和TUTORIAL。结果表明，得到鲜胡椒精油化学成分38种，黑胡椒精油化学成分31种，白胡椒精油化学成分36种，胡椒叶精油化学成分63种。结合MS和部分保留指数，鉴定化学物质见表2。

通过GC-MS数据库搜索和结合文献报道，得出胡椒精油中主要含有单萜、倍半萜、芳烃、醇、脂、醚和酮类等物质，且面积百分比之和均在99%以上，如表3所示。由表3可知，胡椒果与胡椒叶水蒸气蒸馏法所得精油的主要成分萜烯类，含量在90%左右，胡椒叶比胡椒果实含有较多的倍半萜、醇类和脂类。

对4种精油中共有的大量成分进行整理，结果见表4。由表4可知，胡椒果精油中含量最高的是3-蒈烯，蒎烯、柠檬烯、石竹烯和水芹烯的含量次之，月桂烯、间伞花素、δ-榄香烯、葎草烯和α-古巴烯的含量最低；其中除榄香烯、α-古巴烯和葎草烯外，其它成分共有成分在胡椒叶中的含量就明显低于胡椒果（表4）；同时还可发现胡椒叶中的δ-榄香烯的含量非常高。表4中这些大量的共同成分使胡椒果与叶具有相似的气味，而且这些含量较大的物质中有很多具有生物活性。δ-榄香烯具有显著的抗肿瘤作用[16]； D-柠檬烯具有抗肿瘤、抑菌活性，具有祛痰、止咳、平喘、溶解胆结石和镇静中枢神经的作用[17]，复方柠檬烯在临床上用于利胆、溶石、促进消化液分泌和排除肠内积气。药理研究结果表明，石竹烯具有局麻[18]、抗炎[19]等作用。

此外还有一些化学成分，胡椒叶中含量较多，而果中含量较少（<1%）或者没有，结果见表5。它们是甘香烯、α-荜澄茄油烯、β-榄香烯、β-古芸烯、β-古巴烯、α-蛇床烯、花柏烯、4-异亚丙烯-7-甲基-6-亚甲基-2-辛烯酸甲酯和桉油烯醇，其中β-榄香烯属于国家二类非细胞毒性肿瘤药物[16]。

2.3 电子鼻结果分析

对胡椒果与叶的粉末进行电子鼻分析，各个金属氧化电极对样品的响应值见图2，各个样品的响应值RSD<5%，说明样品的重现性很好。电极T30/1和P30/2对胡椒样品的响应较为敏感。

DFA提供正交线性判别函数，在实际应用中2个判别函数来描述大部分的变量就已经足够了，第1个判别函数最能从整体上区分不同的组，第2个判别函数次之。DFA方法的目的就是使组内的差别最小化，使组间的差别最大化[20]。电子鼻工作站自带DFA分析软件，分析结果见图3。由图3可知，第1个判别因子和第2个判别因子的贡献率分别为61.244%与26.762%；在判别因子1的方向上，胡椒鲜果跟黑胡椒、白胡椒和胡椒叶区分开来；在判别因子2上，黑胡椒、白胡椒和胡椒叶三者可以区分开来（图3）。因此，电子鼻很好地区分出黑胡椒、白胡椒、冷冻干燥鲜胡椒和冷冻干燥胡椒叶的气味。

3 讨论与结论

本研究比较了胡椒果与叶的精油成分，结果发现胡椒果与胡椒叶精油中具有一些相同的含量较大的物质，如石竹烯和葎草烯，这使得胡椒果与叶的气味较为相近；同时胡椒果与胡椒叶的精油成分也存在较大的差别，虽然二者均以单萜和倍半萜为主要成分，但胡椒叶精油中倍半萜的含量比例高，而胡椒果精油中单萜的含量比例高，此外胡椒叶精油中醇类物质和脂类物质的含量远远高于胡椒果精油的。这些差别使得电子鼻可以区分出胡椒果与胡椒叶。

此外，本实验所得胡椒叶精油成分与文献报道存在差别。Sumathykutty[15]发现胡椒叶精油的主要成分是榄香醇，含量占检出量的11.5%；其次是石竹烯醇，含量占检出量的4.85%。Bandyopadhyay[21]的研究结果表明，胡椒叶精油中的主要成分是丁香酚和甲基丁香酚。而本实验显示δ-榄香烯可能是胡椒叶精油的主要成分，含量占检出量的38.54%；其次是石竹烯，含量占检出量的16.81%。由于精油成分的易挥发性和不稳定性，这个差别可能跟叶片的干燥方式有关，本实验采用的是真空冷冻干燥，而Sumathykutty[15]采用的是阴干的方法，此外，胡椒栽培地及叶片的采集部位也可能影响结果。值得一提的是，胡椒叶精油中含有的大量成分δ-榄香烯具有抗癌活性[16]，使胡椒叶具有很高的开发价值。

从胡椒果精油中鉴定出的主要成分为α-蒎烯、3-蒈烯、α-水芹烯、D-柠檬烯和石竹烯等，与文献报道的主体香气成分是一致的，如柳中等[11]分析了海南黑白胡椒的香气成分，得出主体香气成分为α-蒎烯、3-蒈烯、α-水芹烯、β-月桂烯、D-柠檬烯和石竹烯等物质；谭乐和等[22]对胡椒挥发油的研究结果表明，胡椒精油的主要成分为3-蒈烯、柠檬烯、反式-石竹烯、β-蒎烯、L-水芹烯、α-蒎烯等。

但也有些报道与本研究存在较大差异，如邱丽丽等[23]用水蒸气蒸馏法分析了白胡椒的挥发性成分，得出其主要成分有（1 S）-3，7，7-三甲基-双环[4.1.0]庚-3-烯、石竹烯和D-柠檬烯等；郑炯等[12]对白胡椒挥发油的分析得出其主要成分为3-蒈烯、柠檬烯、β-蒎烯、石竹烯、α-蒎烯、1-甲氧基-4-（1-丙烯基）苯、α-水芹烯等萜烯类物质；Kapoor等[7]得到黑胡椒精油的主要成分为石竹烯、柠檬烯、蒎烯和香荟烯；Singh等[11]鉴定出黑胡椒挥发油的主要成分为石竹烯、柠檬烯、香荟烯、β-红没药烯和α-古巴烯；Jirovetz等[14]发现黑胡椒挥发油的主要成分为吉马烯D、柠檬烯、蒎烯、α-水芹烯、β-石竹烯和反式-β-罗勒烯。这些差别可能是由胡椒的产地、采摘时间、加工方式及实验条件等因素造成的。

本研究采用GC-MS并结合部分物质保留指数对精油成分进行鉴定，但由于精油成分中有很多物质是同分异构体，对物质鉴定的准确性有一定的影响，因而有必要对精油中的重要成分（如叶中的δ-榄香烯等）进行进一步的定性和定量分析，从而为胡椒叶精油的开发利用提供科学依据。

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