菰SRAP—PCR反应体系的优化与建立

任绪瑞 刘艳玲 杨美 陈媛媛 王冬良 陈友根

摘 要 利用单因素分析法对影响菰SRAP-PCR扩增效果的Mg2+、dNTPs、Taq DNA聚合酶、DNA模板和引物浓度5种因素进行了优化。结果表明：建立了适合菰基因组的SRAP-PCR的体系：1 μL 10×Buffer、0.5 U Taq DNA聚合酶、2 mmol/L MgCl2、50 ng模板DNA、0.20 mmol/L dNTPs、正反向引物的浓度各为0.7 μmol/L，共10 μL。选取5对引物，利用该体系对72份菰样本进行PCR扩增，共获得132条清晰的谱带，其中91条具有多态性，比率为68.9%。菰SRAP-PCR反应体系的优化和建立将为利用该标记进行种质遗传多样性分析和连锁图谱构建等研究提供技术支持。

关键词 菰；SRAP；PCR反应体系；优化

中图分类号 S511.9 文献标识码 A

SRAP（Sequence-related amplified polymorphism，序列相关扩增多态性）是一种不同于RAPD、SSR、AFLP、SNP的分子标记方法，由美国加州大学作物系的Li等[1]于2001年从芸苔属（Brassica L.）植物中研发而来。该标记因具有稳定、简单和易于测序等特性而被广泛应用于植物的品种鉴定[2]、遗传多样性分析[3]、遗传图谱构建[4-5]等研究，其研究对象涉及果树[6]、蔬菜[7-8]和粮食作物[9]等。

菰（Zizania latifolia Turcz.），是稻族（Oryzeae）菰属（Zizania L.）的多年生挺水禾草，具有广泛的利用价值。菰的茎叶是优良的饲料，其嫩茎经过黑粉菌（Ustilago esculenta P. Henn）感染后成为中国重要的水生蔬菜茭白[10]。由于菰和水稻（Oryza sativa L.）亲缘关系较近，且菰具有高产、抗逆性强等优点，是水稻品种改良的重要种质资源[11]。野生菰分布广泛，在许多湿地中是优势种或建群种[12]，对于湖岸带的稳定具有重要的生态功能。虽然野生菰资源具有重要的育种价值和生态功能，目前关于菰野生种群的遗传多样性研究却十分有限，应用的标记有Adh1a序列[13]和SSR标记[14]。SRAP作为一种新型分子标记，虽然在菰品种资源的遗传变异分析中得到初步应用，但其扩增条带产率和多态比率都较低[15]，其反应体系尚需优化。为了有效运用SRAP标记研究野生菰资源的遗传变异，本研究以取自长江中下游和东北三江平原的2份野生菰为材料，对适合菰的SRAP-PCR分析反应体系进行了探讨，为菰种质资源分析、遗传多样性分析和遗传图谱构建等研究提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料 所用2个菰（Z. latifolia）材料分别选自长江中下游的龙感湖（N 30°13′48"，E 116°15′40"）和三江平原黑龙江沿岸（N 49°12′15"，E 129°43′27"）。采集样本的健康幼嫩叶片，放入装有硅胶的密封袋中干燥保存备用。

1.1.2 试剂 由加拿大Fermentas MBI公司生产的10×Taq Buffer（不含MgCl2），5 U/μL Taq DNA polymerase，25 mmol/L MgCl2；由瑞士Roche试剂公司生产的10 mmol/L dNTPs；由美国Promega公司生产的DNA Marker；美国Amresco公司生产的CTAB、Tris-base、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、过硫酸铵、TEMED。SRAP标记引物参照Li等[1]，所选引物序列见表1，由上海桑尼生物技术有限责任公司合成，稀释至10 μmol/L备用。

1.2 方法

1.2.1 菰基因组DNA提取与检测 采用改良的CTAB方法[16]提取植物基因组总DNA；用凝胶成像系统（Bio-Rad Gel Doc XR+）观察检测DNA质量，通过紫外分光核酸测定仪（NanoDrop Lite Spectrophotometer）测定DNA浓度。

1.2.2 SRAP反应体系优化 对影响扩增的Mg2+、dNTPs、DNA模板、Taq DNA聚合酶、引物5个因子进行单因子试验，在反应体系中其它成分不变的情况下，将每个因子设置4个梯度（表2）。PCR反应体积为10 μL，基础反应体系为：模板DNA 50 ng，dNTPs 0.2 mmol/L，10×Buffer缓冲液1 μL，MgCl2 2.0 mmol/L，Taq DNA聚合酶0.5 U，正反引物各0.7 μmol/L。

1.2.3 PCR扩增 本实验使用Bio-Rad MyCycler Thermal Cycler PCR仪进行PCR扩增，PCR反应参考Li等[1]的标准扩增程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，35 ℃复性1 min，72 ℃延伸1 min，5个循环；94 ℃变性1 min，50 ℃复性1 min，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃延伸10 min。

1.2.4 反应产物的检测 于PCR反应产物中加5 μL的上样缓冲液，94 ℃变性5 min后，取样2.5 μL用6%的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，缓冲液为0.5×TBE，以47 W恒功率电泳1.5 h（JY3000高压电泳仪）。取下胶板后置于1 g/L的AgNO3中浸泡15 min，并以去离子水快速冲洗5 s，然后浸入1.5 L的显影液（6 ml甲醛+0.6 g Na2CO3+30 g NaOH）中摇5 min。最后用流水冲洗干净。

2 结果与分析

2.1 菰基因组DNA质量的检测

所提取菰基因组DNA用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示2份菰材料的DNA条带清晰（图1）。紫外分光光度计检测显示，长江中下游龙感湖和东北三江平原黑龙江样本DNA的A260/A280分别为1.987和1.973，A260/A230比值为2.011和2.032， 能够满足SRAP标记技术对DNA质量的要求。2样本的DNA浓度分别为693.6、831.9 ng/μL。

2.2 各因子对SRAP-PCR反应结果的影响

2.2.1 模板浓度 在本试验中，不同浓度的模板DNA普遍扩增较好（图2），但模板为20 ng时，me2em1 B1和me6em3 A1少数条带扩增较弱，me2em1 A1、me8em1 A1条带的背景较深；模板为35 ng时，me6em3和me8em1所扩增条带亮度有所增强，带型比较清晰，但me2em1和me6em1条带的背景比较深；模板DNA为50 ng时，5对引物的扩增效果均比前2种DNA模板用量的效果好，尤其是样本A，A3的条带要比A1、A2、A4更清晰；模板为65 ng时，me2em1 A4、me6em1 A4、me8em1 A4条带的背景较深。通过比较5对引物在不同模板DNA用量下扩增的稳定性，确定最佳DNA用量为50 ng。

2.2.2 Mg2+浓度 从图3中可以看出，Mg2+对PCR的影响很大。Mg2+浓度为1.0 mmol/L时，扩增条带数目较少，带型清晰度不够，如me2em1 A1在145 bp和200 bp处缺少扩增条带，me6em1 A1在300、180、160 bp处缺少扩增条带；随着Mg2+浓度增加，扩增条带数目加强，带型清晰度增加；当Mg2+浓度为1.5 mmol/L时，me2em1 B2、me6em1 A2和me8em1A2、B2均有非特异扩增的条带出现；Mg2+为2.0 mmol/L时扩增效果最好；当Mg2+的浓度达到2.5 mmol/L时，me5em4 B4、me8em1 B4带型的清晰度有所降低。5对引物组合中，Mg2+浓度变化对me2em1的影响最为明显。

2.2.3 dNTPs浓度 由图4可见，4种不同浓度的dNTPs对PCR都产生有效的扩增，只是随着浓度的增加，特异性有所增强，特别是在龙感湖的样本中比较明显。dNTPs浓度为0.1 mmol/L时，条带清晰，但是相对较弱，部分条带有缺少的现象，如me6em3 A1在170 bp处缺少条带；浓度为0.15 mmol/L时，扩增条带数目较多；浓度为0.20 mmol/L时，扩增条带多，带型清晰，多态性最好，在me6em3、me8me1这2对引物的扩增中尤为明显；浓度上升到0.25 mmol/L时，条带清晰度开始降低，me6em3 B4在127、150 bp处，me8em1 B4在110 bp处有条带缺失的现象。因此确定最佳dNTPs浓度为0.20 mmol/L。

2.2.4 Taq DNA聚合酶用量 由图5可以看出，不同浓度的Taq DNA聚合酶扩增的条带亮度相差不是特别明显。但是Taq DNA聚合酶用量为0.25 U时，有少数个体扩增的条带数目减少，例如me8em1 A1在350 bp处有条带缺失的现象；当用量为0.50 U时，条带增多，带型稳定清晰；用量为0.75、1.0 U时，me8em1 A3、A4、B3、B4带型弥散不清晰。本着节约的原则，选择最佳Taq DNA聚合酶用量为0.5 U。

2.2.5 引物浓度 本研究中4种引物浓度下的PCR扩增效果相差不大（图6），条带均比较清晰。具体分析如下：当体系的引物浓度为0.4 μmol/L时，条带较弱且背景较深，如me2em1 A1、me5em4 A1；当引物浓度为0.7 μmol/L时，带型清晰，亮度增加；当增加至1.0 μmol/L时，me6em1 A3、B3、me5em4 A3、B3的条带模糊，背景加深；引物浓度为1.3 μmol/L时，部分引物如me6em A3、A4的带型清晰，但在其他居群及引物组合中扩增效果不好。因此最佳的引物浓度为0.7 μmol/L。

2.3 SRAP-PCR反应体系的验证

根据前面各浓度的单因素梯度实验可以得到适合菰SRAP-PCR的反应体系为：MgCl2 2 mmol/L、DNA 50 ng、Taq DNA聚合酶0.5 U、dNTPs 0.2 mmol/L、正反引物浓度均为0.7 μmol/L，总体积为10 μL。为了检测该体系的稳定性，选用5对引物（me2em1、me6em1、me6em3、me5em4和me8em1），采用该优化体系对本实验室保存的72份菰样进行了扩增（图7）。经统计，5对引物共获得132条清晰的谱带，其中91条具有多态性，比率为68.9%。表明建立的反应体系稳定可靠，可用于进一步的遗传分析。

3 讨论与结论

作为基于PCR的分子标记技术，SRAP与其它PCR技术相似，其扩增结果易受反应体系中多种因素的影响[17-19]。如模板浓度低，模板与引物的结合率小而导致无扩增带，而浓度过高则会引起模板与模板结合率高，同样引起其与引物结合率变小[20]；高浓度的Taq DNA酶会导致非特异性扩增产物的产生，用量偏低又会导致新链合成的效率下降[21]；Mg2+浓度的变化会影响SRAP带型的清晰度，从而影响酶的活性及产物合成的忠实性[22]。此外，引物和dNTPs 浓度等因素也会对扩增结果产生较大影响，因而优化SRAP-PCR反应的条件是获得可靠结果的关键。本试验对Mg2+、dNTPs、引物、Taq酶和模板5种组分进行优化，发现Mg2+对扩增的结果影响最大，另外4种因子对扩增结果也有一定程度的影响，这与对中国兰[23]、红松[24]、石蒜[25]的研究结果相似。另外，也有研究显示在观赏海棠[26]、莲[20]的SRAP-PCR中，dNTPs、Taq酶均是扩增的最大影响因子，表明植物的基因组差异可能导致扩增体系存在差异。

本研究利用5对引物组合共获得132个扩增位点，其中多态位点有91个（占68.9%），其扩增产率和多态性比率与以往对莲[20]、木瓜[27]、葱[28]的研究相似。丁潮洪等[15]曾利用SRAP标记对收集于浙江省的35份菰栽培品种和地方品系进行扩增，然而其扩增产率和多态率明显偏低，利用47对引物仅获得153个扩增位点，其中多态位点11个（占7.2%）。除了扩增反应体系的不同外，这2项研究在扩增产率上存在的巨大差异也许与反应程序有很大相关性。本研究的PCR扩增所用程序参照Li等[1]，最初5个循环退火温度为35 ℃，可使引物与模板易于结合，随后35个循环的退火温度升高为50 ℃，保证了结果的可重复性和扩增产率。在丁潮洪等[15]的研究中，后来循环的退火温度为53 ℃，虽然退火温度的升高会使结果更加稳定，但这将会大幅度降低扩增条带的数目。另外，本研究所选的实验样本分别来源于东北和长江中下游的野外种群，其遗传背景差异较大，因而相对于菰的栽培品种会显示出更高的多态性。

综上所述，根据优化结果，本研究确定了菰SRAP-PCR扩增的最佳反应体系为：MgCl2 2 mmol/L，模板DNA 50 ng，Taq DNA聚合酶0.5 U，dNTPs 0.2 mmol/L，正反向引物浓度均为0.7 μmol/L，共10 μL。检验表明，利用此反应体系扩增谱带清晰、多态性高且稳定性好。本研究为菰的种质资源鉴定、遗传多样性分析、遗传图谱构建、基因定位等研究奠定基础，为后续的研究提供了较好的技术支持。

参考文献

[1] Li G， Quiros C F. Sequence-related amplified polymorphism（SRAP）， a new marker system based on a simple PCR reaction： its application to mapping and gene tagging in Brassica[J]. Theor Appl Genet， 2001， 103（2-3）： 455-461.

[2] 王 燕， 龚义勤， 赵统敏， 等. 番茄SRAP-PCR体系优化与品种分子鉴定[J]. 南京农业大学学报， 2007， 30（1）： 23-29.

[3] Budak H， Shearman R C， Parmaksiz I. Molecular characterization of Buffalograss germplasm using sequence-related amplified polymorphism makers[J]. Theor Appl Genet， 2004， 108（2）： 328-334.

[4] 郑海燕， 粟建光. 红麻种质资源SRAP指纹图谱构建及遗传多样性分析[J]. 湖北农业科学， 2011， 50（2）： 411-415.

[5] Sun Z D， Wang Z N， Tu J X， et al. An ultradense genetic recombination map for Brassica napus， consisting of 13551 SRAP markers[J]. Theor Appl Genet， 2007， 114（8）： 1 305-1 317.

[6] Ahmad R， Potter D， Southwick S M. Genotyping of peach and nectarine cultivars with SSR and AFLP markers[J]. J Amer Soc Hort Sci， 2004， 129（2）： 204-211.

[7] Ferriol M， Pico B， Nuez F. Genetic diversity of a germplasm collection of Cucurbita pepo using SRAP and AFLP makers[J]. Theor Appl Genet， 2003， 107（2）： 271-282.

[8] Ruizj J J， García-Martínez S. Genetic variability and relationship of closely related Spanish traditional cultivars of tomato as detected by SRAP and SSR makers[J]. J Amer Soc Hort Sci， 2005， 130（1）： 88-94.

[9] 武志朴， 杨文香， 刘大群， 等. 小麦基因组SRAP扩增体系的初步研究[J]. 河北农业大学学报， 2005， 28（3）： 66-69.

[10] 刘义满， 柯卫东. 菰米·茭儿菜·茭白史略[J]. 中国蔬菜， 2007（增刊）： 142-143.

[11] 赵基洪， 姜立雁， 初秀成， 等. 水稻与菰属间性状转移研究[J]. 东北师大学报： 自然科学版， 2000， 32（2）： 55-60.

[12] 李 伟. 洪湖水生植被及其演替研究[D]. 武汉： 中国科学院水生生物研究所， 1995.

[13] Xu X W， Ke W D， Yu X P， et al. A preliminary study on population genetic structure and phylogeography of the wild and cultivated Zizania latifolia（Poaceae）based on Adh1a sequences[J]. Theor Appl Genet， 2008， 116（6）： 835-843.

[14] Chen Y Y， Chu H J， Liu H， et al. Abundant genetic diversity of the wild rice Zizania latifolia in central China revealed by microsatellites[J]. Annals of Applied Biology， 2012， 161： 192-201.

[15] 丁潮洪， 华金渭，胡婷婷， 等. 利用SRAP技术分析茭白种质资源遗传多样性[J]. 浙江农业学报， 2010， 22（5）： 576-579.

[16] Doyle J J. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue[J]. Phytochemical Bulletin， 1987， 19： 11-15.

[17] 李建军， 刘志坚， 肖层林， 等. SRAP技术在遗传的研究进展[J]. 现代生物医学进展， 2007， 7（5）： 783-786.

[18] Guo D L， Hou X G， Zhang J. Sequence-related amplified polymorphism analysis of tree peony（Paeonia suffruticosa Andrews）cultivars with different flower colours[J]. J Hortic Sci Biotech， 2009， 84： 131-136.

[19] 郝玉民， 郭 兰， 韩延闯， 等. 甘薯品种的SRAP遗传多样性分析[J]. 武汉植物学研究， 2007， 25（4）： 406-409.

[20] 杨 美， 徐立铭， 刘艳玲. 莲SRAP-PCR反应体系的优化与建立[J]. 植物科学学报， 2012， 30（1）： 85-91.

[21] 徐莹莹， 屈淑平， 崔崇士. 大白菜SRAP-PCR反应体系的优化[J]. 东北农业大学学报， 2008， 39（8）： 31-34.

[22] 陈庆榆， 缪成贵， 刘晓锋. 棉花高质量DNA的提取及SRAP反应体系的优化[J]. 生物学杂志， 2010， 27（5）： 31-34.

[23] 叶兰香， 蒋 彧， 李 萍， 等. 中国兰SRAP-PCR体系的建立及优化[J]. 西南农业学报， 2010， 23（5）： 1 648-1 651.

[24] 冯 健， 王骞春， 于世河， 等. 红松SRAP-PCR反应体系的优化[J]. 辽宁林业科技， 2010（6）： 6-8.

[25] 袁菊红， 权俊萍， 胡绵好， 等. 石蒜SRAP-PCR扩增体系的建立与优化[J]. 植物资源与环境学报， 2007， 16（4）： 1-6.

[26] 楚爱香， 汤庚国. 观赏海棠SRAP-PCR反应体系优化及引物筛选[J]. 湖北农业科学， 2008， 48（12）： 1 394-1 397.

[27] 王明明， 陈化榜， 王建华， 等. 木瓜属品种亲缘关系的SRAP分析[J]. 中国农业科学， 2010， 43（3）： 542-551.

[28] 李慧芝， 尹燕枰， 张春庆， 等. SRAP在葱栽培品种遗传多样性研究中的适用性分析[J]. 园艺学报， 2007， 34（4）： 929-934.