甘蔗几丁质酶基因ScChiⅦ1的克隆与表达分析

王珊珊 苏亚春 杨玉婷 郭晋隆 许莉萍

摘 要 以甘蔗（Saccharum spp. hybrid）抗黑穗病基因型崖城05-179为材料，采用同源克隆法获得了1个几丁质酶基因全长cDNA序列（GenBank登录号为KF279661），命名为ScChiⅦ1，序列长907 bp，编码299个氨基酸，属于糖苷水解酶第19家族，预测为胞外分泌蛋白且兼具溶菌酶活性。聚类分析显示，该基因与其他植物ClassⅦ几丁质酶基因聚为一类。基因组序列（GenBank登录号为KF279662）分析显示，该基因含有2个长度分别为615 bp和86 bp的内含子。实时荧光定量分析结果表明，甘蔗黑穗病菌胁迫下，ScChiⅦ1在抗病（崖城05-179）和感病基因型（柳城03-182）中差异表达，推测ScChiⅦ1可能参与黑穗病菌胁迫的防御反应。组织特异性表达分析结果显示，ScChiⅦ1在甘蔗叶、芽、皮、肉、根中均有表达，但在芽中表达量最高，推测与该病原从蔗芽侵入有关。研究结果为进一步研究甘蔗几丁质酶基因功能及甘蔗与黑穗病菌互作机制提供了有益的信息。

关键词 甘蔗；几丁质酶；克隆；生物信息学分析；黑穗病菌；定量表达

中图分类号 S566.1；Q943.2 文献标识码 A

甘蔗是最主要的糖料作物，全世界食糖产量的78%来自甘蔗[1]。病害是影响甘蔗产量和糖分的重要生物逆境，而真菌性病害是甘蔗生产上最重要的病害，其中甘蔗黑穗病（Sporisorium scitamineum）是我国蔗区最严重的病害之一，大量病原分生孢子由气体传播导致甘蔗黑穗病的再侵染和病害流行[2]。主栽品种新台糖22号对黑穗病抗性差是导致我国黑穗病流行的主要原因，也是该品种宿根产量明显下降的主要的原因[2]。公认提高甘蔗品种抗病性是最经济有效的病害控制策略。长期以来，甘蔗主要依靠杂交育种来提高栽培品种的抗病性，但是，对遗传背景为异源多倍体、非整倍体、基因组庞大、染色体达120条左右的甘蔗（栽培品种）而言，培育高产、高糖、抗病聚合基因型难度大。不仅需要庞大的杂交分离群体，且需要经过10 年或更长时间的产量潜力、稳定性和适应性的鉴定与评价，一般育成优良品种的概率极低，仅为1/250 000[3]。基于以上，发掘功能基因或逆境应答基因，以作为后续转基因改良的目的基因或进一步开发标记辅助选择与评价技术的基础，对甘蔗聚合育种而言无疑是重要的。

几丁质酶（EC.3.2.1.14）是一种糖苷水解酶。该酶通过催化降解病原真菌细胞壁的主要成分几丁质，从而抑制真菌的生长与繁殖[4]。正常情况下，植物体内几丁质酶的含量很低，但当植物受到外源胁迫因子如病原细菌、真菌或病毒侵染后，其表达量迅速提高，van-kan J A 等[5]在研究番茄与真菌性病原叶霉病菌（Cladosporium fulvum）的互作时，就发现了该现象。Broglie等[6]最早通过分子杂交的方法，从菜豆（Phaseolus vulgaris）的cDNA中分离到几丁质酶基因，并将其转化到烟草（Nicotiana tabacum）中，结果显示转化后的植株对立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）的抗性高于对照组，这是植物几丁质酶基因克隆与功能鉴定的首例报道。目前，已从水稻（Oryza sativa）、拟南芥（Arabidopsis thaliana）、菜豆等近100种植物中，克隆到了几丁质酶基因，这些基因分别属于几丁质酶家族的不同类型[7-8]。近年来，利用外源几丁质酶基因导入植物以增强抗病性的成功事例较多。番茄（Solanum lycopersicum）、小麦（Triticum aestivum）、马铃薯（Solanum tuberosum）和香蕉（Musa paradisiaca）等多种植物已获得了转几丁质酶基因的植株[9-12]。顾丽红等[13]将带有修饰过的烟草Ⅰ类几丁质酶基因和Ⅰ类β-1， 3-葡聚糖酶基因的双价植物表达载体，利用农杆菌介导方法，转化甘蔗品种“ROC”10和“ROC”22，转基因后代对甘蔗黑穗病的抗性得到不同程度的提高。但迄今，从GenBank检索到的甘蔗几丁质酶核酸序列有4个，相关EST 也仅有3条，有关甘蔗几丁质酶抗病研究仅有2例报道，都是涉及甘蔗与甘蔗梢腐病原菌（Colletotrichum falcatum或Gibberella fujikuroi）的生物互作系统，其中Sheng Lin等[14]用真菌病原菌Gibberella fujikuroi接种果蔗，对接种0 h和48 h以后的叶片从蛋白质组学、生理学、生物化学和实时荧光定量PCR进行研究，并发现几丁质酶在48 h时表达量最大，作者认为果蔗几丁质酶对Gibberella fujikuroi有一定抗性；Rahul等[15]从接种甘蔗梢腐病原菌后的抗病（Co 93009）和感病（CoC 671）品种分离得到了2个几丁质酶基因，实时荧光定量结果显示，几丁质酶基因在抗病品种的表达水平较高。

本研究借助同源克隆方法，从甘蔗中分离获得几丁质酶基因的全长cDNA和基因组序列。而后，应用生物信息学软件，对基因所编码的蛋白结构和功能进行预测分析。同时，借助实时荧光定量PCR技术，初步研究了该基因的组织表达情况及其在黑穗病菌胁迫下的表达模式。为进一步研究甘蔗几丁质酶基因在抗病育种中的作用，提供一定的基础信息。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 甘蔗基因型（Saccharum spp. hybrid）崖城05-179和柳城03-182来自国家甘蔗产业技术研发中心的甘蔗资源工作圃，供试的甘蔗黑穗病菌采自柳城03-182。实验取崖城05-179和柳城03-182生长健壮、长势一致的蔗茎，砍成双芽段后，采用前人[16]类似方法进行催芽培养，即在清水浸泡24 h，然后置于程控光照培养箱中，采用光照12 h和黑暗12 h交替的方式培养，相对湿度65%，温度为32 ℃。待蔗芽长至2 cm后，以5×106 个/mL甘蔗黑穗病菌孢子悬浮液针刺接种蔗芽后，在28 ℃下培养，其他条件不变。同时，对照处理以注射无菌水代替黑穗病菌，方法参照文献[17]，分别于接种后的第0、6、12、24和48 h，各取5个单芽，迅速用液氮固定，-80 ℃冰箱保存备用。对于甘蔗不同组织部位材料的采集，从田间随机选取5株新植的成熟期甘蔗，表观健康、长势一致的崖城05-179，清水洗净根部泥土，收集白色嫩根，并从地上部位的完整蔗节算起，截取第七和第八节蔗茎节间的蔗芽、蔗皮和蔗髓，以及甘蔗+1叶，所有材料立即放入液氮速冻，再放置在-80 ℃冰箱保存备用。

1.1.2 主要试剂 pMD18-T载体、TAKALA Ex Taq和Prime Script RT-PCR Kit购自TaKaRa公司；E.Z.N.A.TM Plasmid Mini Kit I质粒提取试剂盒、DNA快速纯化/回收试剂盒购自OMEGA生物科技公司；TrizolR Reagent试剂购自Invitrogen公司；荧光定量PCR试剂购自Roche公司；Marker、大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α购自天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 总RNA提取及cDNA合成 按TrizolR Reagent说明书，分别提取崖城05-179和柳城03-182接种黑穗病菌后第0、6、12、24和48小时的蔗芽总RNA。取1.0 μL RNA样品，经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量。参照Prime Script RT-PCR Kit操作说明书，将RNA反转录合成cDNA第1链，用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测质量，并用紫外分光光度计测定cDNA浓度，最后将各处理cDNA浓度稀释至同一浓度。

1.2.2 基因组DNA提取 参照姚伟等[18]的方法，采用CTAB法提取崖城05-179蔗芽基因组DNA，1.0%电泳检测DNA质量后，经紫外分光光度计检测浓度，-20 ℃保存备用。

1.2.3 引物的设计 根据同源克隆方法，搜索同源物种高粱基因组数据库中推定的几丁质酶基因序列（GenBank登录号为XM_002445832），应用Primer Premier 5.0软件设计特异引物，上游引物ScChiⅦ1F：5′-ATGTCCGGGACGCGA-3′，下游引物ScChiⅦ1R：5′-CATATTCTTAGAAGTCAGAACTCT-3′，引物送上海捷瑞生物有限公司合成。

1.2.4 PCR扩增 分别以崖城05-179接种黑穗病菌48 h的反转录产物和崖城05-179蔗芽基因组DNA为模板，以ScChiⅦ1F和ScChiⅦ1R为引物进行目的片段扩增。PCR反应体系参照TAKALA Ex Taq说明书，PCR反应程序为：94 ℃预变性4 min；35个循环PCR扩增（94 ℃，30 s； 60 ℃，45 s；72 ℃，1 min）；72 ℃，再延伸10 min。PCR产物回收后与pMD18-T载体连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，经蓝白斑筛选和菌液PCR验证后，再送上海生物工程技术有限公司测序。

1.2.5 甘蔗几丁质酶基因生物信息学分析 利用在线软件SignalP4.1 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）进行几丁质酶基因蛋白质信号肽分析；借助Scanprosite（http：//www.expasy.ch/tools/scanprosite/）软件，分析蛋白质的序列结构和家族归类；利用Psort（http：//psort.hgc.jp/form.html）程序，进行蛋白的亚细胞定位预测；利用NPS@网站（http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_gor4.html）和SWISS-MODEL生物软件，分别进行蛋白质二级结构和三级结构预测；利用Blast在线软件，将测序结果与其他植物几丁质酶基因的核酸和氨基酸序列进行比对分析；聚类分析中涉及的拟南芥和水稻几丁质酶基因的氨基酸序列从GenBank中获得，并借助Vector NTI软件构建系统进化树。

1.2.6 基因表达分析 根据克隆获得的甘蔗几丁质酶基因的ORF序列，设计特异性实时荧光定量PCR引物，上游引物ScChiⅦ1QF：5′-TACAACCA

CGAATTGAGCCR-3′，下游引物ScChiⅦ1QR：5′-TAGCACCAAAGCCAGGATA-3′。以GAPDH基因（上游引物：5′-CACGGCCACTGGAAGCA-3′和下游引物：5′-TCCTCAGGGTTCCTGATGCC-3'）作为内参基因[19-21]。定量反应体系按照SYBR Green说明书，定量PCR扩增在7 500型实时荧光定量PCR仪（ABI，USA）上完成。每个样品设置3次重复。扩增程序如下：50 ℃，2 min；40个循环PCR扩增（95 ℃，10 min；95 ℃，15 s，60 ℃，1 min）。反应结束后，进行融解曲线分析。采用2-△△CT算法分析基因表达水平[20]。

2 结果与分析

2.1 甘蔗几丁质酶基因的克隆鉴定

根据特异性引物进行cDNA的PCR扩增，产物进行电泳检测，结果见图1-a，显示在900～1 000 bp间有明显的扩增带，与预期目标片段产物条带大小相符。将该片段回收纯化后，选择经蓝白斑筛选和菌液PCR检测鉴定为阳性的克隆，进行测序。测序结果在GenBank数据库进行比对分析，发现其与其他植物几丁质酶基因具有很高的相似性，初步推断该序列为甘蔗几丁质酶基因，命名为ScChiⅦ1，GenBank登录号为KF279661。其基因组序列扩增的PCR产物电泳检测结果见图1-b，测序显示获得一条长1 608 bp的核酸序列，GenBank登录号为KF279662。

2.2 ScChiⅦ1基因生物信息学分析

2.2.1 ScChiⅦ1基因核酸序列和氨基酸序列分析 对ScChiⅦ1基因进行核酸序列分析，结果显示（图2），该基因cDNA全长907 bp，包含1个900 bp的完整开放阅读框（ORF），起始密码子为ATG，终止密码子为TAA，共编码299个氨基酸。基因组克隆分析显示其含有2个内含子，分别为615 bp和86 bp，且均符合“GT-AG”内含子法则。ScChiⅦ1基因推导的编码蛋白，带正电的氨基酸（D、E）29个，带负电的氨基酸（R、K）33个。采用在线软件ExPASy中的ProtParam，预测推导蛋白的相对分子质量为33.06 ku，理论等电点为6.08，表明该蛋白是一种酸性蛋白。

2.2.2 ScChiⅦ1基因编码蛋白的二级结构分析 ScChiⅦ1编码蛋白二级结构分析显示该蛋白无规则卷曲所占比例最高（54.85%），其次是α螺旋结构（25.08%），延伸链和β折叠分别占13.38%和6.69%。

2.2.3 ScChiⅦ1编码蛋白的三级结构分析 以3w3eB（1.50 A）为参考模型，对ScChiⅦ1编码蛋白进行建模分析，结果如图3，可知ScChiⅦ1蛋白的空间结构主要由α螺旋和无规则卷曲构成，这与蛋白质二级结构的预测结果相吻合。将ScChiⅦ1空间构象模拟图与水稻（NP_001062281.1）、小麦（EMS53119.1）、二穗短柄草（Brachypodium distachyon XP_003572384.1）的模拟图进行比较，发现螺旋等空间结构特点基本相同。

2.2.4 ScChiⅦ1编码蛋白的亚细胞定位 Psort软件分析显示ScChiⅦ1基因编码蛋白分泌到胞外的概率为67.6%，存在微体或过氧化物体中的概率为23.0%，存在于溶酶体中的概率为19.0%，推测其为分泌蛋白。

2.2.5 ScChiⅦ1编码蛋白的信号肽预测 借助SignalP4.1 Server在线软件，预测ScChiⅦ1蛋白的信号肽（图4），显示在该蛋白氨基酸序列的第22～23位氨基酸上，有1个潜在的信号肽断裂位点，概率为92.9%，同时，C（原始剪切位点的分值）最大值、Y（综合剪切位点的分值）最高峰和S（信号肽的分值）最大值位于同一个区域，因此，推测ScChiⅦ1蛋白具有信号肽，其信号肽序列为MSGTRGAALLLLLLVTSAAAGG，从第23个氨基酸开始则为成熟蛋白质。

2.2.6 ScChiⅦ1编码蛋白的结构域及功能预测 经Blast比对分析发现ScChiⅦ1蛋白序列存在保守结构域（图5），从第110位-154位氨基酸区域是几丁质酶典型的催化域，属于糖苷水解酶第19家族。同时，ScChiⅦ1编码蛋白具有与溶菌酶超家族基因相似的保守结构域，因此，推测该基因兼具溶菌酶活性。

2.2.7 ScChiⅦ1同源性分析及系统进化树构建 植物几丁质酶基因是家族基因，将本研究中克隆到的ScChiⅦ1基因与水稻（O. sativa NP_001062281.1）、小麦（T. aestivum EMS53119.1）、二穗短柄草（B. distachyon XP_003572384.1）、 绿萝（Epipremnum au

reum BAI63079.1）、油棕（Elaeis guineensis AFV302

04.1）、 山羊草（Aegilops tauschii EMT31181.1）等的几丁质酶基因进行同源性比对，其氨基酸的同源性分别为86%、85%、82%、73%、71%和70%（图6）。借助Vector NTI软件，将ScChiⅦ1编码蛋白与在TAIR（http：//www.arabidopsis.org/）数据库中搜索到的23个拟南芥几丁质酶基因及从NCBI中下载的25个已知的其他植物几丁质酶的氨基酸列[22]，构建了N-J系统进化树（图7）。聚类结果显示ClusterⅢ和ClusterⅤ聚为了一支， ScChiⅦ1被聚类在几丁质酶ClassⅦ。本研究中克隆到的ScChiⅦ1基因编码蛋白的N-端含有一个22个氨基酸的信号肽，具有催化结构域，但不含有几丁质结合区（Chitin-binding domain， CBD），缺少半胱氨酸和脯氨酸的可变交联区，这与前人[23]有关 ClassⅦ几丁质酶的研究结果一致。

2.3 甘蔗黑穗病菌胁迫下ScChiⅦ1基因的表达模式

病原菌侵染植物后，几丁质酶基因转录水平的变化可以反映出该基因参与抗病反应的时间早晚以及可能参与的防御反应机制[24]。本研究利用实时荧光定量PCR技术，获得了2个甘蔗基因型崖城05-179（抗病）和柳城03-182（感病）在黑穗病菌侵染0、6、12、24和48 h时间点ScChiⅦ1基因相对表达量的变化情况。从图8中可以看出，ScChiⅦ1基因在不同基因型中差异表达，对于抗病基因型，总体呈现“先小幅下调后上调”的趋势，在48 h时间点，该基因表达量开始上调；对于感病基因型，总体呈现“先大幅度下调，后上调，再小幅下调”的趋势，在6 h时间点，该基因表达量最小，最高值则出现在接种后的24 h。总体上，ScChiⅦ1基因只是小幅应答甘蔗黑穗病菌侵染的胁迫。

2.4 ScChiⅦ1基因在甘蔗不同组织中的表达特性

以GAPDH基因为内参基因，应用实时荧光定量PCR技术，获得了ScChiⅦ1基因在甘蔗叶、芽、皮、髓和根中的相对表达量（图9），显示ScChiⅦ1在甘蔗上述组织中均有表达，但在芽中的表达量相对较高，约为蔗茎髓部组织中表达量的2倍，其次为叶和皮，分别为髓中表达量的1.67和1.48倍。

3 讨论与结论

当植物受到真菌侵染时，会诱发自身防御机制产生病程相关蛋白，几丁质酶作为一类重要的病程相关蛋白（Pathogenesis-related protein，PR），已被从多种植物中克隆获得并将其作为外源基因导入植物以增强其抗病性[6-13]。植物几丁质酶的分类已修改多次[4]，目前的分类主要有2种，一种是把其分为6类，如许凤华等人借助4个生物学软件（SignalP3.0、TMHMM2.0、TargetP1.1和big-PiPredictor）将水稻的37个和拟南芥的24个几丁质酶基因聚为6类[22]；另一种是根据几丁质酶的结构特点，把其分为7类[24]，其中第1个ClassⅦ几丁质酶基因是从陆地棉中克隆的，该基因与ClassⅠ、ClassⅡ同源性仅为30 %，N-端具有信号肽，但不含有CBD，同时缺少半胱氨酸和脯氨酸的可变交联区[23]。值得注意的是：在本研究获得的N-J系统进化树中，原归入ClusterⅠ的几丁质酶基因AAB23692聚在ClusterⅣ，而拟南芥的2个几丁质酶基因（GenBank登录号为At1g05850和At3g16920）聚在ClusterⅦ，另2个基因（GenBank登录号为At1g 02360.1和At4g 01700.1）聚在ClusterⅠ，这与许凤华等[22]的研究结论不相符，可能是由于聚类过程中所使用的分析软件不同所引起的。

编码蛋白的结构域及功能预测显示，ScChiⅦ1蛋白属于糖苷水解酶第19家族（图5），这与植物几丁质酶分类中只有ClusterⅢ和ClusterⅤ属于糖苷水解酶第18家族，其余类型属于糖苷水解酶第19家族的结果也是一致的[25-27]。对于植物的ClassⅦ几丁质酶基因，在该基因的生物学活性研究方面，仅见Singh等[28]将从小麦中分离到1个ClassⅦ几丁质酶基因在E. coli BL21菌株中实现过表达，所获得的纯化重组蛋白在离体培养的抑菌实验中，表现出了对甘蔗赤腐病菌（Colletotrichum falcatum）、水稻纹枯病菌（Rhizoctonia solani）、茶叶斑病菌（Pestalotia theae）、水稻鞘腐病菌（Sarocladium oryzae）、黑麦病菌（Fusarium sp.）和水稻粒变色病菌（Alternaria sp.）具有广谱的抗性。此外，信号肽对于控制蛋白质的分泌路径和指导蛋白质的定位有重要作用，一般位于分泌蛋白的N-端，由20多个氨基酸组成[3]，这与本研究对所获得的ScChiⅦ1基因的信号肽预测结果（22个氨基酸）是一致的。

前人[29]研究认为，多数病原菌侵染植物是从细胞间隙开始的，病原菌侵入后，阻碍或破坏了植物组织摄取营养，影响了植物正常生长，因此，抗真菌蛋白最好在胞间表达更为有利抵御病原菌的侵染。本研究所克隆的ScChiⅦ1基因通过亚细胞定位，预测其分泌到胞外的概率较大（67.6%），推断该基因如在甘蔗中超表达，其所表达的蛋白可能有助于直接参与对甘蔗黑穗病菌的防御作用。

几丁质酶基因是一种重要的PR基因，在植物受到病原侵染时，其表达量显著增加。油菜（Brassica campestris）受到病原菌Phoma lingam侵染24 h后，抗病品种中Ⅳ型几丁质酶基因的表达量是感病品种的3倍[30]。杨郁文等[30]报道了棉花（Gossypium hirsutum）受到枯萎和黄萎病原菌侵染后，棉花中Ⅲ型和Ⅳ型两类几丁质酶基因在抗、感品种中的表达存在明显差异，其中Ⅳ型仅在抗病品种中呈现表达上调，而Ⅲ型还在棉花感病品种中受黄萎病菌诱导表达。本研究中，黑穗病菌侵染甘蔗后，ScChiⅦ1基因在抗感基因型中的表达模式也存在差异，抗病品种中呈现“抑-扬”的表达模式，而在感病品种中则表现为“抑-扬-抑”的表达模式。该研究结果与前人在棉花-枯黄萎病菌生物系统中的研究结果有一定的相似性和差异[30]，但与前人[31]研究几丁质酶在抗病品种中的表达量明显高于感病品种的表达量的结论是不大一致的，推测可能是由于不同的植物-病原生物互作系统和所研究的几丁质酶基因类型不同所导致的。根据报道，病原菌诱导植物中几丁质酶的表达可能存在不同的机理，如Salzer等[32]在苜蓿菌根形成过程中，发现Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅳ型几丁质酶基因受病原菌诱导表达的时期不同，Ⅰ型和Ⅱ型几丁质酶基因是在成瘤的早期被诱导，而Ⅳ型则是在瘤成熟阶段才被诱导。ScChiⅦ1基因的组织表达特异性分析表明，该基因在甘蔗不同器官（芽、 叶、 髓、 皮、 根）中均有表达，但在芽中的表达量最高，而前人[2]的研究显示黑穗病菌侵染甘蔗的部位是蔗芽而非甘蔗叶片、蔗茎或根部，因此，推测ScChiⅦ1基因在蔗芽中的转录本积累可能起到参与防御黑穗病菌侵染的作用。

综上所述，本研究采用同源克隆法，获得了1个ClassⅦ甘蔗几丁质酶基因ScChiⅦ1（GenBank登录号为KF279661）。该基因与已知的小麦、水稻等植物几丁质酶基因具有较高的同源性，定量分析显示该基因参与了甘蔗黑穗病菌胁迫应答，并在抗、感病性基因型中呈差异应答模式，且在芽中表达量最高，考虑到该病原菌是从蔗芽侵入，推测该基因在抵御病原侵入以及侵入后的生物防御中起作用有关，但是具体功能及其作用机制仍需要进一步的功能验证。

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