紫薯多糖脱蛋白工艺的研究

林翔凯 张龙涛 陈洁 陈玲 郑宝东

摘 要 以紫薯多糖为原料，研究不同酶添加量、时间、温度和pH值对蛋白质脱除率和多糖损失率的影响。通过正交试验法得到酶法脱除紫薯多糖中蛋白的最优工艺，并与Sevag法和三氯乙酸法相比较。结果表明：酶法是最佳的脱蛋白方法，其脱蛋白最佳工艺为：酶添加量为460 U/mL，温度为50 ℃，时间为60 min，蛋白质脱除率为87.71%，多糖的损失率为29.55%。

关键词 紫薯；多糖；酶法；脱蛋白

中图分类号 TS255.36 文献标识码 A

紫薯[（Ipomoea batatas（L.）Lam）]又称紫甘薯、黑薯，薯皮、薯肉分别呈紫黑、紫红色，是甘薯的一种特有品种，在中国河南、广东、福建、河北、广西等地区均有广泛种植[1-3]。已有研究结果表明，紫薯含有多糖、氨基酸、蛋白质、色素等功能性成分，具有很强的抗氧化能力[4-5]，还可预防高血压[6]、改善肝功能[7]、抗肿瘤[8]及抑制诱癌物质的产生[9]。近年来，对于紫薯保健作用和药用价值的研究越来越受到人们的重视。

多糖类物质广泛存在于动物、植物和微生物的细胞壁中，是生物体内除核酸、蛋白质外的又一类重要生物分子，具有降血糖、调节免疫、抗肿瘤等生物活性[10-12]。水提法得到的植物粗多糖中常含有较多的以糖蛋白复合物形式存在的蛋白杂质，脱除难度较大，从而影响了紫薯多糖结构和功效的进一步研究。因此，如何在高效脱除蛋白质的同时尽可能地保留多糖是多糖纯化过程中需要解决的难题，也是制备多糖纯品的必要步骤。

目前，国内外粗多糖脱蛋白的方法主要有Sevag法、盐酸法、酶法、三氯乙酸法和三氟三氯乙烷法等[13-15]。对紫薯粗多糖脱蛋白的报道还较少，尚未见采用酶法对紫薯粗多糖进行脱蛋白的相关报道，因此笔者采用酶法对紫薯粗多糖进行脱蛋白，通过正交试验对其工艺进行优化，并与Sevag法和三氯乙酸法作对比，为紫薯多糖的分离纯化提供了理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试植物 紫薯（紫罗兰品种）购自福建长乐。

1.1.2 药品或试剂 木瓜蛋白酶购自北京奥博星生物技术责任有限公司；牛血清蛋白、考马斯亮蓝 G-250、无水乙醇、正丁醇、氯仿、浓硫酸、苯酚、葡萄糖、碳酸氢钠、氢氧化钠、氯化钠等均为分析纯；实验用水为二次蒸馏水。

1.1.3 设备或仪器 Phs-3C型精密pH计购自上海精密科学仪器有限公司；UV-2000型紫外可见分光光度计购自尤尼柯（上海）仪器有限公司；AL104型精密分析天平购自梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；FZ102植物粉碎机购自天津市泰斯特仪器有限公司；RE-52A型旋转蒸发器购自上海亚荣生化仪器厂；L530型台式低速离心机购自长沙高新技术产业开发区湘仪离心机仪器有限公司；丹瑞HH-6型数显恒温水浴锅购自江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司；试验标准筛购自上虞市银河测试仪器厂。

1.2 方法

1.2.1 紫薯多糖的提取 紫薯洗净、去皮、切片→烘干（45 ℃， 6 h）→粉碎、过筛（60目=250 μm）→热水浸提（70 ℃、 3 h）→抽滤→旋转蒸发浓缩（55 ℃）→95%乙醇沉淀→离心→水溶解→粗多糖溶液。

1.2.2 多糖含量的测定[16-17] （1）标准曲线的绘制：精确称取经干燥的标准葡萄糖20 mg，定容至500 mL，制得葡萄糖标准溶液。分别吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mL葡萄糖标准溶液，以水补至2.0 mL，然后加入6%苯酚水溶液1.0 mL，再迅速加入浓硫酸5.0 mL，显色后于冷水中冷却15 min。以水代替糖溶液作空白对照，于490 nm处测定吸光度。得到回归方程为：

Y=6.623 2X+0.001 6（R2=0.998 8）

其中X：葡萄糖溶液浓度，单位mg/mL；Y：吸光度OD值。

（2）样品中多糖含量的测定：吸取样品液1.0 mL，按上述步骤操作，测定吸光度，代入回归方程计算多糖含量。

1.2.3 蛋白质含量的测定[18] （1）标准曲线的绘制：精确移取牛血清白蛋白标准溶液（浓度为0.1 mg/mL）0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，依次置于6支试管中，分别加入去离子水补至1 mL，摇匀。每管中加入5.0 mL染色液，摇匀，室温静置3 min。以空白溶液作对照，于595 nm波长处测定吸光度。得到回归方程为：

Y=4.995 7X+0.009 4（R2=0.995 0）

其中X：牛血清白蛋白溶液浓度，单位mg/mL；Y：吸光度OD值。

（2）样品中蛋白质含量的测定：吸取样品液1.0 mL，按上述步骤操作，测定吸光度，代入回归方程计算蛋白质的含量。

1.2.4 酶法脱蛋白试验 （1）单因素试验：考察木瓜蛋白酶添加量：60、160、260、360、460 U/mL（温度60 ℃、时间60 min、pH为原液pH6.98），温度：20、30、40、50、60、70 ℃（木瓜蛋白酶添加量160 U/mL、时间60 min、pH为原液pH6.98），时间：40、50、60、70、80、90 min（木瓜蛋白酶添加量160 U/mL、温度60 ℃、pH为原液pH6.98）和pH值：4.00、5.00、6.00、6.98、8.00、9.00（木瓜蛋白酶添加量160 U/mL、温度60 ℃、时间60 min）这些因素对蛋白质脱除率的影响。酶解液经4 000 r/min离心10 min，取上清液测定多糖和蛋白质的含量。

（2）正交试验：在单因素试验结果的基础上，选择影响蛋白脱除率较大的3个因素进行正交试验，得到酶法脱除紫薯粗多糖中蛋白质的最佳工艺参数。

1.2.5 Sevag法 取多糖样品液40 mL，加入10 mL Sevag试剂[氯仿 ∶ 正丁醇=4 ∶ 1（V ∶ V）]。将混合物剧烈振摇20～30 min，蛋白质变性生成凝胶，离心分离，除去水层和溶剂层交界处的变性蛋白质。取少量溶液测定多糖和蛋白质含量，再向溶液中加入其1/4体积的氯仿-正丁醇溶液，重复上述步骤5次。

1.2.6 三氯乙酸法 取多糖样品液50 mL，加入50 mL的3%三氯乙酸，使溶液完全混合均匀。于5～10 ℃冰箱中放置过夜，离心除去沉淀，测定多糖和蛋白质的含量。

1.2.7 计算公式 多糖损失率=（C1-C2）/C1×100%

其中，C1：处理前的多糖浓度（mg/mL），C2：处理后的多糖浓度（mg/mL）。

其中，C3：脱蛋白前的蛋白质浓度（mg/mL），C4：脱蛋白后的蛋白质浓度（mg/mL）。

1.3 数据处理

采用DPS数据处理系统对试验数据进行统计学处理与分析。

2 结果与分析

2.1 不同酶添加量对紫薯多糖蛋白质脱除率和多糖损失率的影响

由图1可知，蛋白质脱除率随着酶添加量的增加而增大，在460 U/mL时达到最大；多糖损失率也随着酶添加量的增加而缓慢增大。这可能是因为保持反应体系中其它成分不变，随着酶浓度的上升，酶与底物接触的机会增加，蛋白质脱除效果明显增大；而多糖有一部分发生水解，并且随着蛋白质脱除率的增大也造成多糖的一部分损失，但并不明显。同时，在酶添加量为460 U/mL时蛋白质脱除率已高达88.47%，考虑到酶的成本与生产效益及多糖的损失，选择460 U/mL为酶解的最适酶添加量。

2.2 不同温度对紫薯多糖蛋白质脱除率和多糖损失率的影响

由图2可知，在20～50 ℃温度范围内，随着温度的升高，蛋白质脱除率基本不变；当温度高于50 ℃，蛋白质脱除率显著增加。这与酶的作用最适温度有关，低温抑制了酶的活性，而温度大于50 ℃可激发酶的活性。多糖损失率随着温度的升高而增大，50 ℃后基本保持不变。这可能是因为酶促反应的加剧造成部分多糖的损失，并且随着温度的升高部分多糖发生水解[19]。但多糖损失增大的趋势并不明显，因此选择70 ℃为酶解的最适温度。

2.3 不同时间对紫薯多糖蛋白质脱除率和多糖损失率的影响

由图3可知，当酶解时间在40～70 min 时，蛋白质脱除率随着时间的延长而增加，70 min后蛋白脱除率几乎不变。这可能是因为在70 min时酶促反应基本完成，当酶浓度不变时，延长酶促反应的时间并不能使蛋白质脱除率显著增加[13]。而多糖随着反应时间的延长发生部分水解，多糖损失率随着时间的延长而缓慢增加。因此，选择70 min为最佳酶解时间。

2.4 不同pH值对紫薯多糖蛋白质脱除率和多糖损失率的影响

由图4可知，当pH值为4.0时，蛋白质基本被脱除干净，随着pH值的增大，蛋白质脱除率显著下降，在pH值为7.0～9.0时，蛋白质脱除率基本保持不变，停留在20%左右的较低水平；而多糖损失率在酸、碱条件下显著提高。这可能是因为酸、碱易造成糖苷键断裂，使多糖发生水解。因此，选择原液的pH为脱除蛋白质的最适pH值既方便、效果也最好。

2.5 正交试验

以蛋白质脱除率为指标，对酶添加量（A）、温度（B）和时间（C）3个因素进行正交试验，得到酶法脱除紫薯粗多糖中蛋白质的最佳工艺参数。正交试验因素水平表和正交实验结果见表1和表2。

由表2可以看出，影响蛋白质脱除率的主次因素是A>B>C。酶法脱除紫薯粗多糖蛋白质的最优工艺参数为A3B1C1，即酶添加量460 U/mL，温度50 ℃，作用时间60 min。在此条件下，蛋白质脱除率为87.71%，多糖损失率为29.55%。对正交实验结果进行方差分析（表3），结果可以看出酶添加量达极显著水平（p<0.01），温度和时间对蛋白质脱除率效果影响不显著。

2.6 Sevag法脱蛋白

使用Sevag试剂对紫薯粗多糖溶液进行脱蛋白处理5次，蛋白质脱除率和多糖损失率情况见表4。

表4可知，Sevag法脱蛋白3次后，蛋白质脱除率稳定，但多糖损失率却逐渐上升。经过5次脱蛋白后，蛋白质脱除率只有64.99%，多糖损失率却高达46.48%。因此选择Sevag法脱蛋白3次为最佳，此时蛋白质脱除率62.89%，多糖损失率31.19%。

2.7 不同脱蛋白方法的比较

对不同脱蛋白方法的蛋白质脱除率和多糖损失率进行对比研究，由表5可知，酶法是最佳的紫薯粗多糖脱蛋白方法，蛋白脱除率可高达87.71%，而多糖损失率仅为29.55%。

3 讨论与结论

本实验以蛋白脱除率和多糖损失率为评价指标，采用蛋白酶法、Sevag法和三氯乙酸法对紫薯多糖溶液进行脱蛋白处理，通过对比可知，Sevag法与三氯乙酸法脱蛋白工艺有机溶剂回收的工作量大，易造成环境污染，且多糖损失率较高；而酶法操作过程简单，蛋白质脱除效果最好，且多糖损失率较低，是最好的脱蛋白方法。其脱蛋白最佳工艺为：酶添加量460 U/mL、温度50 ℃、酶解时间60 min。在此工艺条件下，紫薯多糖蛋白质脱除率为87.71%，多糖的损失率为29.55%。

此结果与已报道的其它紫薯多糖脱蛋白的研究结果相一致。高秋萍等[19]采用Sevag法、三氯乙酸法、Sevag法和三氯乙酸法相结合的方法对紫薯多糖进行了脱蛋白，结果表明三氯乙酸法是相对较好的脱蛋白方法。贾琳璐[20]比较研究了Sevag法、三氯乙酸法、硫酸铵沉淀法对紫薯多糖的脱蛋白效果，结果表明Sevag法脱蛋白效率低，有机溶剂易残留，且多糖的损失较大；三氯乙酸法脱蛋白效率较高，但容易引起多糖的降解；硫酸铵沉淀法为相对较好的脱蛋白方法，硫酸铵饱和度为40%，其蛋白质脱除率为80.75%，多糖损失率为25.98%，此结果与酶法脱蛋白效果相似。但硫酸铵沉淀法与酶法相比操作更加繁琐，耗时更久，而且会增加多糖溶液的体积，降低多糖溶液的浓度，影响对紫薯多糖的进一步研究。因此，酶法脱蛋白是相对较好的脱蛋白方法。

同时，张怡等[13]研究了金柑多糖酶法脱蛋白工艺，结果表明酶法脱蛋白的效率较高，蛋白质脱除率可达75.88%，多糖的损失率为5.45%；张一芳等[21]研究了枸杞多糖酶法脱蛋白工艺，结果表明酶法脱蛋白效果优于Sevag法，其蛋白质脱除率为78.56%，多糖损失率为10.53%；邱承军等[22]在研究酶法脱蛋白提取大枣多糖工艺时也证实了酶法脱蛋白效果最好。

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