桐花树内生细菌动态及拮抗植物病原菌菌株筛选鉴定

卢乃会 严玉宁 何红 黄勤知

摘 要 以荧光显微计数法和平板分离法分别对桐花树根茎叶内生细菌总量和可培养细菌数量进行周年动态初步测定，并对拮抗植物病原菌的可培养细菌菌株进行筛选鉴定。结果表明：桐花树根茎叶内均含有大量的内生细菌，其中根部内生细菌总量为0.88×107～49.67×107 ind./g FW，7月份最大，叶部细菌总量为1.07×107～65.07×107 ind./g FW，也以7月份最大，茎部细菌总量为1.1×107～19.73×107 ind./g FW，以5月份最大；而根茎叶可培养细菌含量分别为1.02×103～13.18×103、0.13×103～11.24×103、0.31×103～10.36×103 CFU/g FW，均以3月份数量最大，周年不同月份之间细菌总量和可培养细菌数量均差异显著。用平板对峙生长法，从86株可培养内生细菌中筛选获得1株对香蕉叶鞘腐败病菌、香蕉枯萎病菌、马拉巴栗茎腐病等植物病原菌均有较强拮抗作用的Aec23菌株，经形态、生理生化测试及16S rDNA序列比较分析，Aec23菌株初步鉴定为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）。

关键词 桐花树；内生细菌；时空动态；植物病原菌；拮抗细菌

中图分类号 S476 文献标识码 A

红树林由于生长于海岸潮间带的特殊生境，导致其共附（内）生微生物类群的复杂性和独特性[1-3]，因此有关红树林微生物的研究近年来已越来越多，成为研究的热点之一。国内外学者Ravikumar[4]、Hong[5]等分别对红树林放线菌种群多样性和相关活性物质进行了研究报道，邓祖军[6]、Peng[7]等对红树内生真菌种群多样性及其活性物质进行了研究，并从中获得功能特殊、结构新颖的抗菌活性物质。但有关红树内生细菌周年数量时空动态变化，目前尚未见报道。本实验室近年来对红树内生细菌及其在生防植物病害中的作用开展了一系列研究，不仅获得了多株对不同植物病原具有良好防病效果的内生细菌菌株及其抗菌活性物质，同时也证明了红树内生细菌是植物病害生物防治不可多得的资源菌来源。为此，笔者以广东湛江湾分布广、面积大的桐花树为研究对象，在调查其内生细菌周年时空变化动态的同时，以香蕉枯萎病菌（Fusarium oxysporum f.sp. cubense）、香蕉叶鞘腐败病菌（Pantoea agglomerans）、马拉巴栗茎腐病菌（Phytophthora palmivora）和芒果炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）等为供试病原菌，从桐花树可培养内生细菌中筛选对植物病原真菌、细菌和卵菌均有拮抗作用的菌株，并对其进行了鉴定。为红树内生细菌资源调查研究以及广谱型植物病害生防菌株的筛选利用等提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试植物 红树植物桐花树（Aegiceras corniculatum），于2010年1～11月（奇数月份）采自广东湛江红树林自然保护区（21°20′N～21°25′N，109°50′E～109°53′E），编号封存带回实验室进行内生细菌分离。

1.1.2 供试培养基 海水NA培养基用于内生细菌平板计数测定（蛋白胨10.0 g，牛肉浸膏5.0 g，琼脂20.0 g，过滤海水1 000 mL，pH7.2～7.4）；LB培养基用于拮抗菌株基因组DNA的提取（胰蛋白胨10.0 g，酵母浸出粉5.0 g，氯化钠10.0 g，蒸馏水1 000 mL，pH7.2～7.4）；PDA培养基用于菌株拮抗效果测定（马铃薯200.0 g，葡萄糖20.0 g，蒸馏水1 000 mL，琼脂20.0 g）；NB培养基用于菌株发酵（蛋白胨10.0 g，牛肉浸膏5.0 g，蒸馏水1 000 mL，pH7.2～7.4）。

1.1.3 供试病原菌菌株 香蕉叶鞘腐败病原菌（Pantoea agglomerans）[8]；芒果炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）；香蕉枯萎病菌（Fusarium oxysporum f.sp. cubense）；马拉巴栗疫霉病菌（Phytophthora palmivora）[9]，均为本实验室分离鉴定和保存。

1.2 方法

1.2.1 桐花树可培养内生细菌数量测定 样品用自来水冲洗干净，晾干后分别称取根、茎、成熟叶片各5.0 g，75%酒精表面消毒30 s后，再用0.1%升汞表面消毒（对应40 s、1 min、2 min），用无菌海水冲洗3次，阴干后加20 mL无菌海水于灭菌研钵中剪碎研磨，浸泡15 min后，吸取样品浸泡液100 μL涂布于海水NA培养基平板上，25 ℃黑暗培养箱中培养，4～7 d后观察计数，每样品3次重复。根据菌落形态、颜色等挑取单菌落，纯化保存备用。

1.2.2 桐花树内生细菌总数测定 参考赵海萍[10]等海洋细菌荧光显微计数法（略有改进）：取1.2.1中浸泡液，加入40%甲醛溶液（终浓度1%）固定，吸取100 μL固定液至带有黑色微孔滤膜的抽滤装置管中，并滴加1～2滴吖啶橙（终浓度为0.1%）染色3 min，真空抽滤。将滤膜置于载玻片上，Olympus BH22荧光显微镜下100倍观察，计算样品内生细菌总数。计算公式为：E=（×S1×V0）/（m×S2×V1）。其中：E：样品中的细菌含量（个/g）；：计数视野细菌数量的平均值（个）；S1：滤膜面积（mm2）；S2：显微镜的视野面积（mm2）；V0：浸泡样液体积，即20 mL；V1：过滤样液体积，即0.1 mL；m：植物样品质量g。

1.2.3 拮抗菌株的筛选 病原细菌拮抗菌株筛选参照陈振明[11]等的方法稍加改进：取NB、37 ℃、150 r/min振荡培养24 h的香蕉叶鞘腐败病菌于NA培养基上制成含菌平板，然后接种1.2.1中活化的细菌菌株，于28 ℃下黑暗培养24～48 h，观测其抑菌圈大小，每处理重复3次。

病原真菌拮抗菌株筛选采用对峙生长法，在PDA平板中央接种供试病原菌菌块，离平板边缘1.5 cm处对角线接种1.2.1中活化的细菌菌株，28 ℃下黑暗培养72～96 h，观测其抑菌圈大小，每处理重复3次。

1.2.4 拮抗菌株形态学观察和生理生化试验 参照《伯杰氏细菌鉴定手册》[12]和《植病研究方法》[13]进行。

1.2.5 菌株16S rDNA序列分析 取LB培养基，37 ℃、120 r/min恒温振荡箱中黑暗培养24 h的Aec23菌株，以CTAB法[14]提取细菌基因组DNA为模板，以27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1504R（5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′）为上、下游引物扩增其16S rDNA序列。PCR体系为25 μL：10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTPs（2.5 mmol/L） 2.0 μL，引物27F/1504R（10 μmol/L）2.0 μL，模板DNA（约50.0 mg/mL）1.0 μL，Taq酶0.2 μL，ddH2O补充至25 μL。PCR扩增条件：95 ℃ 5 min，94 ℃ 1 min、53 ℃ 1 min、72 ℃ 1 min 40 s，30循环，72 ℃ 10 min。琼脂糖凝胶电泳并回收目标片段，送上海生工生物工程技术服务有限公司测序，测序结果用BLAST软件在GenBank进行同源性比较，以Clustal X[15]进行多序列比对后，用MEGA 5.0的Neighbor-Joining法[16]构建系统发育树，并进行1 000次Bootstraps检验。

1.2.6 数据分析与处理方法 所测数据采用SPSS 17.0软件进行数据统计分析。

2 结果与分析

2.1 桐花树内生细菌总量及动态变化

用吖啶橙染色荧光显微计数法测定桐花树内生细菌总量结果表明（表1），桐花树根茎叶内含有大量的内生细菌，不同时间、不同部位其内生细菌的数量有所不同。根部和叶部不同月份数量变化趋势基本相同，内生细菌总量分别为0.88×107～49.67×107、1.07×107～65.07×107 ind./g FW，均在7月份数量最大，其不同时间数量变化趋势为7月>3月>5月>9月>11月>1月；茎部内生细菌总量为1.1×107～19.73×107 ind./g FW，5月份达到最大值，各时期数量变化趋势为5月>7月>11月>9月>3月>1月。叶部内生细菌的数量显著高于茎部和根部。

2.2 桐花树可培养内生细菌数量及动态变化

可培养内生细菌测定结果表明（表2），桐花树根茎叶中可培养内生细菌数量随部位和时间变化不同。各部位可培养内生细菌数量均在3月份数量达到最大值，根部和茎部可培养内生细菌含量周年变化趋势相似，分别为1.02×103～13.18×103、0.13×103～11.24×103 CFU/g FW，各时期变化动态为3月>11月>7月>5月>1月>9月；叶部可培养内生细菌含量为0.31×103～10.36×103 CFU/g FW，其不同时间数量变化趋势为3月>7月>9月>5月>11月>1月。通过比较发现，根部的可培养细菌含量较之茎部和叶部含量丰富。

2.3 植物病原拮抗菌株的筛选

本研究从桐花树体内共分离获得86株可培养内生细菌，以香蕉叶鞘腐败病菌、芒果炭疽病菌、香蕉枯萎病菌及马拉巴栗疫霉病菌等植物病原细菌、真菌和卵菌等为供试菌，平板对峙测定发现，以来自桐花树根部Aec23菌株对上述供试病原菌的抑菌效果最强且稳定（图1），其抑菌圈直径分别达（10.0±0.03）、（14.0±0.05）、（12.8±0.02）、（11.5±0.05）mm；进一步提取该菌株发酵上清液测定其抑菌圈直径分别达（12.7±0.05）、（17.2±0.07）、（15.9±0.02）、（16.8±0.03）mm（图2）。说明Aec23菌株对植物病原真菌、细菌和卵菌均有较强的拮抗作用。

2.4 拮抗菌株Aec23的鉴定

2.4.1 菌落形态特征观察及生理生化测试结果 Aec23菌株在NA平板上菌落规则，圆形，边缘加厚，乳白色，蜡质。生物显微镜下观察菌体呈杆状，革兰氏染色阳性。生理生化测定（表3）：该菌株为好氧菌，厌氧条件不生长；可以使明胶液化，能水解淀粉和还原硝酸盐，不能分解纤维素，不产生H2S；在pH5.7的培养基中可以生长，具有耐盐性，可以在7%的NaCl培养基中生长；生长温度为15～40 ℃，最适生长温度为25～30 ℃；接触酶试验呈阳性，氧化酶、色氨酸脱氨酶及苯丙氨酸脱氨酶试验均呈阴性；不产生吲哚；葡萄糖发酵产酸不产气；甲基红试验呈阴性，乙酰甲基甲醇试验呈阳性；不利用丙二酸，柠檬酸盐生长试验为阳性（指示剂蓝色）。

2.4.2 菌株分子生物学鉴定 生防菌株Aec23的16S rDNA测序片段大小为1 515 bp（GenBank登录号为KF181458），用BLAST软件进行同源性比较，通过与GenBank中的核酸数据进行对比分析，菌株Aec23与解淀粉芽孢杆菌（登录号：AY651023）同源性高达99.8%。以16S rDNA为基础，利用MEGA 5.0软件按Neighbor-Joining法构建了包括解淀粉芽孢杆菌及同属的临近种细菌在内的系统发育树（图3）。生防芽孢杆菌Aec23与解淀粉芽孢杆菌同处一支，遗传进化距离最近。结合菌株的生化试验及16S rDNA序列分析，生防芽孢杆菌Aec23初步鉴定为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）。

3 讨论

目前，细菌计数方法主要有平板直接计数法、荧光显微计数法和流式细胞仪计数法等。较只分离可培养细菌的平板直接计数法[17]和前处理较复杂的流式细胞仪计数法[18]，荧光显微计数法由于简捷、快速、方便、可靠，且样品易于保存，能较好反映样品中细菌的实际数量，现已在多个领域应用[10]，但用于内生细菌含量测定却鲜见报道。本研究采用吖啶橙荧光染色计数法对桐花树内生细菌进行了分析，结果发现在显微镜下可观察到大小、颜色和形状各异的内生细菌，说明该法用于植物内生细菌含量测定是可行的，结果对植物内生细菌的相关研究具有一定的参考价值。

关于红树林内生菌的研究，目前以内生真菌和放线菌报道较多，邓祖军等[19]对桐花树内生真菌类群进行了研究，发现不同部位、不同季节环境因素可直接影响内生真菌的定居和分布；唐依莉[20]等的研究结果表明，红树内生放线菌的定殖因宿主植物部位、年龄及季节和环境的变化明显不同；相关性研究说明红树微生物数量动态变化受季节和分离部位的影响。本研究对桐花树总内生细菌和可培养内生细菌数量测定结果表明，其细菌总量以5～7月份较高，而可培养细菌数最大值出现在3月份，说明桐花树内生细菌总量及可培养细菌数量均随采样时期不同而显示出明显的波动。本研究结果还表明，桐花树内生细菌总量与可培养细菌总量之间存在明显差异，可培养细菌量仅占其总量的0.126‰ （0.005‰～0.768‰），说明桐花树体内存在有大量的不能培养或难培养的细菌类群，这与相关研究报道结果相似。关于桐花树内生细菌种群多样性尚有待进一步研究。

近年来本实验室利用红树内生细菌生防植物病害进行了较为系统的研究，已从红树植物老鼠簕、木榄和红海榄体内分离获得多株对香蕉枯萎病、芒果炭疽病、辣椒青枯病、辣椒疫病等植物病害具有较好防病作用的内生细菌菌株[21-24]。本研究又从桐花树中筛选获得1株对香蕉叶鞘腐败病菌等植物病原细菌和真菌均有明显抑制效果的Aec23菌株，进一步说明红树植物内生细菌是植物病害生物防治不可多得的资源[23]。有关Aec23菌株防病效果及防病机理等尚有待进一步研究。

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