海南八门湾红树林丛枝菌根真菌物种多样性

张伟　陈熠　李增平

摘 要 调查了海南八门湾8种红树植物根际丛枝菌根真菌物种资源的分布。结果表明：8种红树均被丛枝菌根真菌侵染，但侵染程度各不相同；经初步分离、鉴定，共确定丛枝菌根真菌4属16种：分别为无梗囊霉属（Acaulospora）6种，巨孢囊霉属（Gigaspora）2种，球囊霉属（Glomus）7种，Fuscutata 1种。其中球囊霉属和无梗囊霉属为优势属，首次在红树植物根际分离到巨孢囊霉属和Fuscutata两属真菌，Fuscutata savannicola为我国丛枝菌根真菌新记录种。

关键词 红树林；丛枝菌根真菌；物种多样性；Fuscutata savannicola

中图分类号 Q939.5 文献标识码 A

红树林生长于热带及亚热带海岸滩涂附近，受海水周期性浸淹，被誉为“海上森林”。它蕴含着丰富的动植物以及微生物资源，具有非常重要的生态和经济价值[1]。丛枝菌根真菌（arbuscular mycorrhizal fungus，AMF）广泛分布于自然界中，能与绝大多数植物形成紧密联系的共生体系，是一类极其重要的土壤微生物[2]。国外Sengupta[3]等报道了AMF存在于红树林生态系统之中；国内王桂文[4]等对钦州湾红树林丛枝菌根进行初步研究；Wang等[5]也对深圳福田和珠海红树林丛枝菌根真菌进行了研究。但国内有关红树林AMF资源的研究还相对较少，尚需进一步完善。海南岛八门湾是海南岛面积最大、树种最多、红树群落保持较完整的红树林自然保护区[6]，笔者对八门湾红树林根际AMF物种多样性进行了初步调查，对该区域内AMF物种数量及其分布进行研究，以期为进一步研究红树林AMF，开发红树林AMF资源提供参考。

1 材料与方法

1.1 样品采集

2012年10月至2013年5月间，2次在海南省文昌市八门湾红树林保护区的不同红树群落区域内进行土样采集（表1）：随机选择5株树龄较长、长势良好的红树植株，在离气生根约10 cm 处采样，首先去掉表面枯叶腐殖层（1～5 cm）；后挖取0～15 cm深的土壤装袋（土壤质量约5 kg）；样品采回后于阴凉处自然凉干，去除杂质后保存备用。采集土壤样品时兼采集植株根样放入FAA液（95%乙醇50 mL、40%甲醛5 mL、冰醋酸5 mL、蒸馏水35 mL）中低温保存备用。

1.2 AMF的分离和鉴定[2]

1.2.1 根样处理 将FAA固定液中的根系剪成1 cm小段，放入烧杯清水冲洗，然后加入5% KOH溶液，在90 ℃水浴锅水浴约60 min，嫩根时间稍短，老根则适当延长时间；水浴后用水清洗数次，再加入2% HCl溶液浸泡2～3 min；清洗掉酸液后加入0.01%酸性品红乳酸甘油染色（乳酸875 mL、甘油63 mL、蒸馏水63 mL、酸性品红0.1 g），放回90 ℃水浴锅水浴约60 min；回收染液，将根样清洗数次后镜检[7]。

经过上述处理的根样，挑取制片并置于显微镜下观察拍照，记录下AMF在每个根段上的侵染情况，计算出每个根段的侵染率，取平均值为根样侵染指标。

侵染率=（具有丛枝菌根结构的根段长度/观测根段长度）×100%。

根样侵染率=∑（具有丛枝菌根结构的根段长度/观测根段长度）/观察总根段数×100%。

1.2.2 AMF分离 取风干土样20 g，放入大烧杯中加500 mL清水搅拌均匀，浸泡40 min后过双层分样筛（上层20目，下层400目）。反复洗筛土样，收集下层筛子上的残留物于大号离心管中，在离心机中以1 500 ×g离心3 min；去掉上清液后加入浓度45%蔗糖溶液，搅拌均匀后快速放入离心机，以400 ×g离心2 min后迅速将上清液过400目筛，用清水清洗掉糖液后将筛中孢子收集到培养皿中置于解剖镜下计数，计算样品孢子密度（个/20 g土样）。

1.2.3 AMF鉴定 将分离取得的孢子，用水做浮载剂、加Melzer's染液制片，于光学显微镜下观察孢子的形状、颜色、孢壁颜色、壁层结构、组成、孢子内含物等，测量孢子的大小、孢壁厚度。于OLYMPUS BX51TRF生物摄影显微镜下拍照。参照最新分类系统[8]和国际丛枝菌根真菌菌种保藏中心（INVAM，http：//invam.caf.wvu.edu）提供的种的描述和图片，王幼珊[9]著《中国丛枝菌根真菌资源与种植资源》中AMF种的描述与国内相关文献进行种类鉴定。

2 结果与分析

2.1 不同红树植物根部AMF的侵染

对八门湾八种红树植物根样进行染色镜检，发现其根部有AMF，根部可见清晰的菌丝、侵入点、泡囊等结构（图1）。所采集根样均被AMF侵染，但侵染程度各有不同。从宿主种类来看，海桑>银叶树>海南海桑>木果楝>正红树>海莲>木榄>白骨壤；从采样时间来看，2013年5月所采集土壤样品中孢子密度明显大于2012年10月所采集样品中孢子的密度，表明红树植物根际AMF孢子数量随季节交替存在周期性变化（表2）。

2.2 AMF物种多样性

2.2.1 AMF的种类及分布 对8种红树根际土壤样品中AMF孢子进行分离、鉴定，初步确定有4属（Acaulospora、Gigaspora、Glomus、Fuscutata）16种AMF，其中Fuscutata savannicola为中国新记录种。各种AMF分布情况如表3所示。

从表3中可看出，在已鉴定出的菌根真菌中，海桑根际的AMF种类最多，有Acaulospora、Gigaspora、Glomus、Fuscutata 4属共11种，其次是海莲有Acaulospora、Gigaspora、Glomus 3属共8种。正红树及白骨壤种类最少，分别仅有1属1种。球囊霉属种类最多，有7个种，其次是无梗囊霉属有6个种。

2.2.2 已鉴定的AMF记述

（1）细齿无梗囊霉Acaulospora denticulata Sieverding & Toro，1987（图3-A）：孢子球形或近球形，直径125～170 μm，黄色至黄棕色。孢子壁两层（L1/L2），L1黄色至黄棕色，厚2～10 μm；L2透明，厚约1 μm；孢子壁在Melzer's 试剂中无明显变化。孢子外壁可见多边形或不规则形纹饰。标本号：HL-121110-02。样本号：HL01。

（2）格担无梗囊霉Acaulospora gedanensis J. Blaszkowki，1988：孢子球形、近球形或椭圆形，直径50～90 μm，浅黄色至黄棕色，孢子内的透明内含物在Melzer's试剂中染色呈现出浅黄色。孢子壁两层（L1/L2），L1黄色至黄棕色，厚2～7 μm；L2与L1紧贴，淡黄色，厚约2 μm；孢子壁在Melzer's试剂中无明显变化。孢子壁外有细小突起。标本号HS-130614-06。样本号：HL02、HS02。

（3）光壁无梗囊霉Acaulospora laevis J. W. Gerdemann & J. M. Trappe，1974：孢子球形或近球形，直径100-200 μm，黄色至浅棕色，表面光滑。孢子壁三层（L1/L2/L3），L1光滑，厚1～2 μm；L2黄色至黄棕色，厚2～5 μm；L3无色，厚约2 μm；孢子壁在Melzer's试剂中无明显变化。标本号HS-130614-17。样本号：HS02、HNHS02、MGL01。

（4）波兰无梗囊霉Acaulospora polonica J. Blaszkowski，1988.：孢子球形或近球形，直径80-250 μm，透明至白色。孢子壁两层（L1/L2），L1无色透明，厚约0.5 μm，易脱落；L2无色透明，厚约1.5 μm；孢子壁在Melzer's 试剂中无明显变化。标本号：HS-130614-13。样本号：HS02。

（5）细凹无梗囊霉Acaulospora scrobiculata J. M. Trappe，1977（图3-B）：孢子球形或近球形，直径80～150 μm，淡黄色至黄褐色，孢子表面密布圆形、卵圆形或多角形的凹坑纹饰。孢子壁三层（L1/L2/L3），L1无色透明，厚约1 μm；L2淡黄色至黄褐色，厚4～6 μm，在Melzer's 试剂中呈浅黄色；L3与L2紧贴，无色透明，厚约1 μm。标本号：HS-121226-04。样本号：HS01、YYS02。

（6）刺无梗囊霉Acaulospora spinosa C. Walker & J.M. Trappe，1981（图3-C）：孢子球形或近球形，直径90～180 μm，浅黄色至黄棕色，孢子表面布满针状刺突，高约1～5 μm。孢子壁单层，厚2～5 μm，在Melzer's试剂中无明显变化。标本号：HS-130613-21。样本号：HS02。

（7）极大巨孢囊霉Gigaspora gigantean（Nicol. & Gerd.）J. W. Gerdemaxm & J. M. Trappe，1974（图3-D）：孢子球形或近球形，黄绿色，表面光滑（170～300）μm×（200～350）μm。内含颗粒状物。孢子壁三层（L1/L2/L3），L1淡黄色，厚2.5～3.5 μm；L2黄绿色，厚5～25 μm，在Melzer's试剂中呈紫红色；L3与L2紧贴，颜色相同，厚约1 μm。产孢细胞大小（20～35）×（22～36）μm，淡黄色。标本号：HS-130613-19。样本号：HL01，HS02。

（8）分支巨孢囊霉Gigaspora ramisporoaphora J.L.Spain，E.Sieverding & N.C.Sehenek，1989（图3-E）：孢子球形或近球形，大小（250～350）μm×（250～400）μm，黄色至黄棕色。内含颗粒状物。孢子壁三层（L1/L2/L3），L1无色透明，厚2～4 μm；L2黄色至黄棕色，厚5～10 μm，在Melzer's 试剂中呈紫红色；L3与L2颜色相同，厚约1 μm，有小突起纹饰。产孢细胞大小（30～55）μm×（35～65）μm，淡黄色。标本号：MGL-121127-03。样本号：HL01、HS02、MGL01。

（9）棒孢球囊霉Glomus clavisporum（Trappe）R.T.Almeida&N.C.Schenck，1990（图3-F）：孢子椭圆形或卵圆形，黄棕色至暗棕色，大小（50～90）μm×（60～130）μm。孢壁单层，厚度均匀，光滑，黄棕色至暗棕色，厚2～5 μm，在Melzer's试剂中无明显变化。连孢菌丝黄色至黄棕色，连点呈漏斗状，不封闭。标本号：YYS-121203-02。样本号：HL01、YYS01、HNHS01、ML01。

（10）德里球囊霉Glomus delhiense Mukerji，Bhattacharjee & Tewari，1983（图3-G）：孢子球形或近球形，直径90～130 μm，黄褐色，孢子表面粗糙，内含颗粒状物。孢子壁两层（L1/L2），L1黄褐色，是层状壁，有孔道，靠L2端有横坎，厚3～8 μm；L2无色，可见向内的斑点突起，厚2～3 μm。连孢菌丝延伸段扭曲，连点直筒状。在Melzer's试剂中呈红褐色。标本号：HL-130629-06。样本号：HL02、HS02、BGR02。

（11）长孢球囊霉Glomus dolichosporum M. Q.Zhang，Y.S.Wang&L.J.Xing，199：孢子倒卵形、椭圆形或长椭圆形，大小（60～100）μm×（100～170）μm，黄棕色至红棕色。孢子壁二层（Ll/L2），L1黄色或黄棕色，厚度较均匀，厚3～9 μm；L2黄色至黄棕色，层状，厚1～3 μm。菌丝连点圆柱形或者近漏斗状，连点处有隔或无隔。标本号：YYS-130629-03。样本号：YYS02。

（12）象牙白球囊霉Glomus eburneum L. J. Kennedy，J.C.Stutz，J.B. Morton，1999：孢子球形或近球形，直径50～130 μm，透明至淡黄白色。孢子壁两层（L1/L2），L1无色透明，厚1～2 μm；L2透明至浅黄色，孢子压碎易皱缩，厚2～3 μm。连孢菌丝无色透明，有隔。标本号：HS-130614-03。样本号：HL01，HS02。

（13）小果球囊霉Glomus microcarpum L. R. Tul.&C.Tul.，Giorn，1845（图3-H）：孢子聚生在土壤中，球形或近球形，直径20～60 μm，淡黄色至黄棕色。孢子壁单层，较光滑，厚2～6 μm，连孢菌丝宽5～7 μm，连点不封闭。在Melzer's试剂中染色无明显变化。标本号：HNHS-130620-05。 样本号：HNHS02。

（14）悬钩子球囊霉Glomus rubiforme（Gerd. & Trappe）R.T.Almeida&N.C.Schenck，1990（图3-I）：孢子聚生在土壤中，倒卵形或椭圆形，大小（25～50）μm×（30～80）μm，黄色至黄棕色。孢子壁单层，较光滑，厚1～6 μm，连孢菌丝宽5～9 μm。在Melzer's试剂中无明显变化。标本号：YYS-130624-01。样本号：HL02、HS02、ZHS02、ML02、YYS02。

（15）弯丝球囊霉Gtomus sinuosum（Gerd. & B. K. Bakshi）R.T.Almeida&N.C.Schenck，1990：孢子倒卵形或椭圆形，大小（25～60）μm×（50～100）μm，黄色至黄褐色。孢子壁单层，厚3～8 μm，通常孢子的内壁可见向内的棒状突起，壁上有辐射状小沟，基部有一小孔通向连孢菌丝，连孢菌丝宽6～10 μm。在Melzer's试剂中无明显变化。标本号：YYS-130629-06。样本号：ML02、YYS02。

（16）Fuscutata savannicola（R.A.Herrera&Ferrer）Oehl，F.A.Souza & Sieverd.，comb. nov. Basionym：Scutellospora savannicola（R.A.Herrera&Ferrer）C.Walker & F.E.Sanders，1986[10]（图4）：孢子果未知。孢子土中单生，端生或侧生于产孢细胞上。孢子透明至白色，卵形至椭圆形，孢子大小（280～580）μm×（210～370）μm；产孢细胞鳞茎状，透明至浅黄色，大小33～51 μm。孢壁三组（外壁Ow、中壁Mw、内壁Iw）：Ow三层（L1/L2/L3），均无色透明，表面光滑无特异性纹饰；Mw二层（L1/L2），无色透明；Iw二层（L1/L2），无色透明，L1上具发芽盾室。Melzer's中Mw、Iw-L2呈紫红色。发芽盾室浅黄棕色至棕色，双裂叶，椭圆形至心形，具4条蝌蚪纹，大小（100～160）μm×（90～140）μm，具有两个芽管萌发位点。

该种AMF孢子在形态、大小等特征方面极易与原三红盾巨孢囊霉（Fuscutata trirubiginopa）混淆。但是该种孢子上发芽盾室具有4个显著的蝌蚪形裂痕，且Melzer's染色处理后Fuscutata trirubiginopa的Ow-L2、Mw、Iw-L2均呈浅紫红色至深紫红色，而Fuscutata savannicola仅Mw、Iw-L2有染色反应。标本号：HS-20130613-10。样本号：HS02。

3 讨论

3.1 AMF孢子密度季节性变化

目前，关于AMF孢子动态变化的研究较少，研究成果较为零乱。李凌飞等[11]认为AMF的孢子密度和物种丰富度在冬季最高而春、夏、秋相对较低，主要因为宿主植物在冬季时生长和光合作用减缓或停止，光合产物减少，而大多数无性繁殖的真菌在营养不良时会产生大量的繁殖体（孢子）以渡过不适时期；同时，低温、干燥的土壤环境也非常利于孢子的保存。海南岛全年气候不存在显著差异，据报道红树植物在进入5月后生长较快，进入10月生长开始减慢，逐步进入休眠期[12]，这与孢子密度的周期性变化相一致。

3.2 AMF侵染率的差异

不同红树树种根际菌丝侵染率不同，这可能与红树植物所处位置相关。红树植物发达的氧气输送机制为AMF的生长提供了可能，但处在不同位置的红树植物根际的实际氧含量却不相同。海桑、海南海桑等的气生根常处于半淹没或未淹没状态，根部土质疏松，气生根发达，摄氧量高，利于AMF的生长繁殖；海莲、正红树、木榄在涨潮时气生根则处于全淹没状态，摄氧量次之；白骨壤通常生长在离岸稍远且高出海平面的土埂上，土质较为致密，相比之下摄氧量最少，这浸淹形成的摄氧量梯度与AMF侵染差异相一致。与Wang等[5]对深圳福田红树林丛枝菌根研究中的获得的结果相同。。

3.3 红树植物根际AMF物种多样性

本次调查初步确定16种AMF，其中球囊霉属和无梗囊霉属为优势属。同时，首次在红树植物根际分离到巨孢囊霉目（Gigasporale）中2属真菌，其中Fuscutata savannicola为国内新记录种，进一步丰富了红树植物根际AMF的物种多样性。此外，已鉴定AMF中有15种均已见于梁昌聪、石兆勇、高秀兵、邵金诚、盖京萍等的报道[13-19]，表明海南植物根际土壤中AMF种类存在一定的相似性。从初期的研究结果来看，海南八门湾的红树植物根际具有较为丰富的菌根真菌资源，本文只对所鉴定出的菌根真菌种类进行了报道，尚有部分待鉴定的种类在进一步的研究中。

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