双水相体系协同超声提取法分离定心藤总黄酮

李维峰等

摘要[目的]以定心藤为原料，研究超声耦合乙醇-硫酸铵双水相体系提取定心藤总黄酮最佳工艺。[方法]通过单因素试验和正交试验对影响定心藤的料液比、硫酸铵浓度、乙醇浓度和超声时间等因素进行探讨。[结果]影响定心藤总黄酮提取因素的主次顺序为乙醇浓度>超声时间>硫酸铵浓度>料液比，最优提取条件为乙醇浓度80%、料液比1∶50、超声时间30 min、硫酸铵质量浓度为0.30 g/ml，在此条件下，定心藤总黄酮得率为2.02%。[结论]该研究可为定心藤总黄酮提取工艺的设计提供一定的理论依据。

关键词双水相；定心藤；总黄酮；超声耦合

中图分类号S567；R284文献标识码A文章编号0517-6611（2014）36-12904-03

Abstract[Objective] With Mappianthus iodioides as raw material， the research aimed to study the flavonoids extraction process from Mappianthus iodioides by ultrasonicassisted alcoholammonium sulphate aqueous twophase system. [Method] To determine the optimal extraction conditions， the effect of the conditions， such as the ethanol concentration， the solidliquid ratio， the amount of the ammonium sulfate， the ultrasonic time， were studied by the single factor experiment and the orthogonal test. [Result] The results showed that the order of factor to affect total flavones extraction was ethanol concentration> ultrasonic time> ammonium sulfate concentration>material to extraction solution ration. The optimum extracting conditions were as follows： the volume fraction of alcohol 80%， solid to solution ratio of 1∶50， ultrasonic time 30 min， the ammonium sulfate 0.3 g/ml. At the optimum conditions， the extraction rate of the flavonoids could reach 2.02%. [Conclusion] The study provides the theoretical basis for the flavonoids extraction process of Mappianthus iodioides.

Key wordsAqueous twophase； Mappianthus iodioides； Total flavones； Ultrasonic coupling

傣族 “雅解”药中定心藤称为邓嘿罕，是“雅解”药多种单方或复方解药的重要药物之一，为茱萸科植物定心藤Mappianthus iodioides Hand.Mazz的干燥藤茎。据《傣药学》记载，该药性凉、味甜，具有清火定心、利胆退黄、通气止痛的功效，主治心慌心跳、烦热不安、头目胀痛、咽喉干痛、尿频尿急、热涩疼痛、黄疸、跌打损伤、骨折、风湿热痹肢体关节红肿热痛[1]。相关研究表明，定心藤中含有黄酮、生物碱、强心苷、酚性成分、有机酸、皂苷、鞣质及氨基酸等类别的化学成分[2-5]，但关于定心藤中总黄酮化合物的提取研究报道较少[6-7]。

双水相提取技术始于20世纪60年代，是利用物质在互不相容的两相中分配系数的不同来进行提取分离的方法[8]。传统聚合物与无机盐形成的双水相体系因为聚合物粘度较大，导致成本较高、提取物的后续处理比较困难等缺点，最近发展由低级醇如乙醇、丙醇与盐组成双水相体系[9-11]，该法具有提取分离条件温和、过程易于应用于实际生产、生物适应性广等优点，被广泛应用于生物提取、天然产物分离、食品化工等行业[12-15]。该研究拟采用超声耦合乙醇-水-硫酸铵双水相提取定心藤总黄酮，并通过单因素试验和正交试验对提取条件进行优化，为定心藤中总黄酮的提取开发利用提供基础。

1材料与方法

1.1试验材料

定心藤新鲜藤茎采自云南省普洱市柏枝寺，经云南农业大学热带作物学院马晓老师鉴定为真品。样本切片，于60 ℃干燥后粉碎过40目筛，冷藏备用。

1.2试验试剂

芦丁标准品，国家标准物质中心；其他试剂均为国药集团分析纯试剂。

1.3主要仪器

FW200万能粉碎机；上海科导SK5210HP超声清洗仪；上海精科UV759紫外-可见分光光度计；梅特勒AL204电子分析天平；上海一恒DZF6053真空干燥箱。

1.4试验方法

1.4.1乙醇-硫酸铵双水相体系制备。

在一定浓度的硫酸铵溶液中加入无水乙醇，利用硫酸铵的盐析作用形成双水相体系，并通过改变乙醇的比例和硫酸铵的浓度控制双水相体系的组成[16]。

1.4.2标准曲线的绘制。

总黄酮含量的测定采用分光光度法，配制0.2 mg/ml芦丁为标准溶液，分别取1.00、2.00、300、4.00、5.00、6.00、7.00 ml于25 ml比色管中，加入1 ml 5%NaNO2溶液，搖匀后放置6 min，然后加入1 ml 10%Al（NO3）3溶液，摇匀后放置6 min，再加入6 ml 4%NaOH溶液，用30%乙醇定容至刻度线[16]，摇匀，放置15 min后于510 nm波长处测定吸光度，以吸光度为横坐标、芦丁浓度为纵坐标绘制标准曲线，得到回归方程A=12.559x + 0.003 4，相关系数R2=0.999 6。

1.4.3样品总黄酮的提取。取1 g定心藤干粉于100 ml圆底烧瓶中，按照超声功率500 W、超声温度60 ℃[6]，分别研究不同料液比（1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60）、不同硫酸铵浓度（0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40 g/ml）、乙醇浓度（50%、60%、70%、80%、90%）、不同超声时间（10、20、30、40、50、60 min）对定心藤总黄酮提取率的影响。

1.4.4正交试验设计。

为了对提取工艺进行优化，在上述单因素试验基础上，选择浸提料液比、硫酸铵浓度、乙醇浓度和超声时间4个因素按照L9（34）设计四因素三水平试验（表1）。

1.4.5样品总黄酮的分析。

取1 ml定心藤提取液，于25 ml比色管中，加入1 ml 5%NaNO2溶液，摇匀后放置6 min，然后加入1 ml 10%Al（NO3）3溶液，摇匀后放置6 min，再加入6 ml 4%NaOH溶液，用30%乙醇定容至刻度线[15]，摇匀，放置15 min后于510 nm波长处测定吸光度，利用回归方程计算样品中总黄酮含量，并按照下面公式计算总黄酮提取率，即总黄酮得率（%）=（提取液中总黄酮质量/原料质量）×100%。

2结果与分析

2.1单因素影响试验

2.1.1料液比对提取的影响。

从图1可以看出，料液比直接影响定心藤总黄酮的得率，料液比过大或过小均不利于总黄酮的提取，料液比过小，溶剂体积过少，黄酮类从样品中扩散到溶剂中的速率低，且极易达到饱和状态；料液比过大，不但会在加热过程中造成能力的浪费，更会因溶剂用量过多、硫酸铵用量增大，影响双水相的稳定性，从而导致总黄酮的得率下降，因此选用1∶40（m/v）为最佳料液比。

3结论与讨论

超声波可以使细胞壁在超声空气化产生的巨大压力下瞬间破碎，并通过聚能效应、微扰效应和界面效应等提高传质速率和效果，从而对黄酮类化合物的提取起到很好地辅助效果[17]。在乙醇-硫酸铵双水相体系中，黄酮类分配于乙醇上相，而其他水溶成分如多糖、氨基酸等分配于盐水下相，从而很好地实现黄酮类化合物与其他杂质成分的分离，提高黄酮类成分的纯度及提取效率。

笔者通过单因素试验和正交优化试验设计，将超声提取与乙醇-硫酸铵双水相分离技术耦合集成，研究了定心藤中总黄酮的提取最佳工艺，并通过试验验证最佳工艺下总黄酮的得率，发现在乙醇浓度80%、硫酸铵浓度0.30 g/ml配制双水相溶液、料液比1∶50（g/v）、超声提取时间30 min的条件下，定心藤总黄酮平均得率可达2.02%，该工艺耗时短、提取分离简单、得率较高，具有很高的实际生产应用价值。

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