外源水杨酸SA对盐胁迫下黄连种子萌发及幼苗生理特性的影响

张春平等

[目的]通過对黄连种子萌发及幼苗生理特性的研究，寻找提高黄连种子及幼苗在盐胁迫条件下抗性能力的途径。[方法]用100 mmol/L的NaCl模拟盐胁迫，在外源水杨酸（SA）处理后，对黄连种子的发芽势（Gv）、发芽率（Gr）、发芽指数（Gi）、活力指数（Vi），以及黄连幼苗叶片细胞质膜透性、O2-· 产生速率、H2O2含量、可溶性糖、可溶性蛋白、游离脯氨酸及丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT） 和抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性进行测定。[结果] NaCl胁迫下的黄连种子萌发受到显著抑制，但在经过不同浓度的SA处理后，各萌发指标均有升高。试验结果表明，外源SA处理显著提高了黄连种子发芽势、发芽率、萌发指数和活力指数，明显提高了盐胁迫下黄连幼苗叶片可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸含量，不同程度地提高了叶片超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）活性，显著降低了叶片丙二醛（MDA）含量、质膜透性、O2-· 产生速率及H2O2含量。[结论]外源SA通过提高黄连种子的萌发指数，提高渗透调节物质含量及抗氧化酶活性，降低细胞质膜氧化程度，有效地减缓NaCl 胁迫对黄连种子及幼苗产生的伤害，提高了种子及幼苗的抗盐能力。

关键词黄连；亚精胺；盐胁迫；种子萌发；生理特性

Abstract[Objective] In order to get the method of improving the salt resistance of seeds and seedlings for Coptis chinensis Franch. under NaCl stress， seed germination and physiological characteristics of C. chinensis seedlings were studied. [Method] Several physiological indexes of C. chinensis seeds and seedlings treated by exogenous salicylic acid under NaCl stress like the germination vigor， germination rate， germination index and vigor index were measured. And other indexes like the memberane permeability， H2O2 content， production rate of O2-， the contents of soluble surge， soluble protein， free proline， and malondialdehyde （MDA）， the activities of superoxide （SOD）， peroxidase （POD）， catalase （CAT）， and ascorbate peroxidase （APX） were also measured. The germination indexes of C. chinensis seeds under NaCl stress have an obvious inhibition. But after the treatment of salicylic acid， every germination indexes were all increased. [Result] The result showed that the treatment of exogenous salicylic acid obviously improved the germination vigor， germination rate， germination index and vigor index， increased the content of soluble sugars， free proline， and soluble protein， decreased the content of malondialdehyde （MDA）， H2O2 content， production rate of O2-· Meanwhile， the results also indicated that salicylic acid improve the activities of superoxide （SOD）， peroxidase （POD）， catalase （CAT）， and ascorbate peroxidase （APX）. [Conclusion] Exogenous salicylic acid with appropriate concentration could significantly alleviate the damages to the seeds and seedlings of C. chinensis under NaCl stress and promote the salt resistance of the seeds and seedlings through improve the germination indexes and antioxidase activities， decrease the memberane permeability and so on.

Key wordsCoptis chinensis Franch.； Spermidine； Salt stress； Seed germination； Physiological characteristics

黄连Coptis chinensis Franch.又名味连、川黄连、鸡爪连，为毛茛科黄连属多年生草本植物，三级渐危种[1]。野生黄连大多分布于四川、重庆、湖南、湖北、陕西、贵州省海拔1 200～1 700 m的山谷密林之中。黄连性寒、味苦，根茎入药，具有清热燥湿、泻火解毒等作用[2]，临床上还用于细菌性痢疾、局部化脓性感染、心律失常、胃炎及十二指肠溃疡等病的治疗[3]。由于黄连根茎有效成分小檗碱的独特药效，使得药材市场对其需求量逐年增加，目前对黄连的研究主要集中在化学成分、药理作用、临床应用及资源保护等方面[4-5]。对黄连栽培过程中的环境胁迫主要集中在热胁迫、冷胁迫、干旱胁迫等方面，但对盐胁迫的报道较少，且对外源性物质处理缓解胁迫的报道仅见于极少量文献[6]。

土壤盐渍化是农业栽培生产中主要障碍之一，目前我国的盐渍土地面积不断扩大，对农业生产造成了巨大的经济损失。水杨酸（SA）属苯丙氨酸代谢途径产物，属于肉桂酸的衍生物，被认为是一种内源信号物质和新型植物激素，可诱导植物产生抗病性、抗热性、耐寒性和抗旱性，影响根部对离子的吸收和运输，调控细胞的生长和死亡。但在调控植物抗盐胁迫中鲜见报道。该研究以黄连种子和幼苗为材料，研究亚精胺（Spd）对NaCl胁迫下的黄连若干生理生化指标的影响，找到Spd对盐胁迫的缓解调节机制，为黄连在栽培生产中遇到的盐胁迫问题提供理论依据和解决方法。

1材料与方法

1.1 材料

供试的黄连种子及两年期黄连幼苗均由重庆石柱黄连培育基地提供，经西南大学生命科学学院何平教授鉴定为C. chinensis Franch.的干燥成熟种子。亚精胺（Spd）为Sigma公司生产。

1.2 方法

1.2.1

种子萌发生理指标的测定。

挑取籽粒饱满、大小一致的黄连种子，用1.0%的次氯酸钠（NaClO）溶液消毒处理5 min，蒸馏水冲洗3～5次，将种子表面水分用滤纸吸干，以铺有双层滤纸和双层纱布的培养皿为发芽床，进行种子发芽试验。胁迫所用的NaCl浓度为100 mmol/L，试验共设置6个处理，即水对照（CK）、100 mmol/L的NaCl盐处理（S）、100 mmol/L NaCl +5 mg/L SA（T1）、100 mmol/L NaCl +10 mg/L SA（T2）、100 mmol/L NaCl +20 mmol/L SA（T3）、100 mmol/L NaCl +50 mmol/L SA（T4）。在处理黄连种子时，处理液浇透培养皿底部，再覆盖浸透处理液的滤纸，然后吸取培养皿多余的处理液，以免种子被处理液掩埋而影响萌发，种子在培养箱中进行（23±2）/（ 15±2） ℃（昼/夜）的变温培养，光照时间设为12 h/12 h（昼/夜），光照强度为2 500 lx。每个培养皿100粒种子，4次重复，每天定时统计发芽数，第28天计算发芽势（Gv），第40天计算发芽率（Gr）、发芽指数（Gi）和活力指数（Vi）。计算公式分别为发芽势（Gv）= （28 d内发芽的种子数/供试的所有种子数）×100%、发芽率（Gr）=（40 d内发芽的种子/供试的所有种子数）×100%、发芽指数（Gi）=∑ （Gt/Dt）、活力指数（Vi）=S×∑ （Gt/Dt），式中，Gt为t日内的发芽数，Dt为相应的发芽天数，S为植株的平均鲜重。

安徽农业科学2014年

1.2.2

幼苗相关生理指标的测定。

选取长势一致的两年期幼苗移入小花盆中，每盆植入一株，盆中基质按松针土

∶腐殖土∶沙土=2∶2∶1的比例混合形成。经过10 d的缓苗期后，进行盐胁迫试验，共设置6个处理，即Hoagland营养液空白对照（CK）、Hoagland营养液+100 mmol/L NaCl盐处理（S）、Hoagland营养液+100 mmol/L NaCl +10 mg/L SA（T1）、Hoagland营养液+100 mmol/L NaCl +25 mg/L SA（T2）、Hoagland营养液+100 mmol/L NaCl +50 mg/L SA（T3）、Hoagland营养液+100 mmol/L NaCl +100 mg/L SA（T4），每个处理10株幼苗，3次重复，每天定期向花盆内补充Hoagland营养液。分别于盐胁迫后的第5、第10和第15天进行取样，取样时选取植株中等大小的功能叶片。测量的相关指标包括幼苗叶片质膜透性、质膜氧化程度（丙二醛含量、O2-·产生速率及H2O2含量）、可溶性糖含量、游离脯氨酸含量、可溶性蛋白含量、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）和抗坏血酸过氧化物酶 （APX）的活性。 可溶性糖、可溶性蛋白和游离脯氨酸含量均采用张志良等的方法[7]进行测量，含量分别以mg/（g·FW）、mg/（g·FW）和μg/（g·FW）来表示。黄连幼苗叶片的原生质膜透性采用电导仪法测定[8]，以相对电导率来表示细胞膜受胁迫伤害的程度，相对电导率=未煮之前的电导率/煮沸后的电导率×100%，测量用电导仪型号为LIDA DDS-307W。H2O2含量采用Lee等的方法[9]进行测定，在436 nm 下测量吸光度，根据标准曲线计算含量，单位为μmol/（g·FW）。

O2-· 产生速率采用张志良等的方法[10]进行测定，在530 nm处的吸光值，单位为μmol/（g·min·FW）。

丙二醛（MDA）含量参照Velikova等的硫代巴比妥酸（TBA）检测法[11]，分别于532和600 nm处检测吸光度，以μmol/（g·FW）表示丙二醛含量。

超氧化物歧化酶（SOD）活性的测定采用Xu等的方法[12]，在560 nm处检测吸光度，单位为U/（mg·protein）；过氧化物酶（POD）活性的测量方法采用愈创木酚法进行测量[13]，检测波长为465 nm，单位为U/（mg·protein）；过氧化氢酶（CAT）活性的测量方法采用Dhindsa等的方法[14]，检测波长为240 nm，单位为U/（mg·protein）；抗壞血酸过氧化物酶（APX）活性的测量方法采用Nakano等的方法[15]，于290 nm处检测吸光度，单位为U/（mg·protein）。

1.2.3

数据处理。采用SSPS 12.0统计软件对数据进行方差分析，以Duncans新复级差法比较不同处理间的差异性。

2 结果与分析

2.1 SA对盐胁迫下黄连种子萌发的影响

从图1可以看出，黄连种子在不同的处理下，发芽率和发芽势均有不同程度的变化；与未经任何处理（CK）的发芽势（55.36%）和发芽率（78.49%）相比，100 mmol/L的NaCl处理（S）的种子发芽势（25.17%）和发芽率（39.22%）显著降低，表明NaCl处理显著抑制了黄连种子的正常萌发；当用不同浓度的SA处理后，黄连种子的发芽势和发芽率与NaCl处理（S）相比均有不同程度的提高，其中经过10 mg/L的SA处理后（T2）的结果最为显著，发芽势和发芽率达52.21%和76.00%，与其余各SA处理相比差异显著。发芽指数和活力指数的变化趋势与发芽势和发芽率的变化相似，经过NaCl处理后，发芽指数也显著降低，但经过不同浓度的SA处理后，发芽指数和活力指数均有明显的升高，且也是在经过10 mg/L的SA处理后结果最为显著，发芽指数（32.30）和活力指数（370.00）达最大，显著高于盐处理S（16.37和180.39），分别为S处理的1.97和2.05倍，比空白对照（CK）略低，但差异不显著。说明适宜浓度的SA可有效缓解盐胁迫对黄连种子萌发造成的伤害，在提高黄连种子各萌发生理指标中具有显著的促进效应。

2.2SA对盐胁迫下黄连幼苗叶片细胞膜脂过氧化及质膜透性的影响

从盐胁迫下黄连叶片O2-·产生速率及H2O2含量的变化（图2a、b）可看出，经过NaCl进行胁迫后，两者均有

不同程度的升高；在胁迫初期，两者水平与对照组CK相比均发生显著升高，且随着胁迫时间的延长，提高幅度不断变大；

当用外源SA进行处理后，两者均有不同程度的降低。SA在处理初期对O2-·产生速率的影响表现为低浓度处理效果并不明显，但随着浓度的升高，效果越来越明显，在浓度为50 mg/L时（T3）时降到最小值[1.290 μmol/（g·min·FW）]，且低于空白对照CK[1.249 μμmol/（g·min·FW）]。在SA处理初期，H2O2含量有明显的降低，且同样在浓度为50 mg/L时（T3）达最小值[1.43 μmol（g·FW）]，接近于空白对照CK[1.32 μmol/（g·FW）]，说明SA显著地缓解了盐胁迫下黄连叶片H2O2含量升高的趋势。由盐胁迫下丙二醛（MDA）含量的变化（图2c）可见，未经任何处理的黄连叶片MDA含量随着时间的延长并无显著变化，而经过NaCl处理后（S）的黄连叶片MDA含量自胁迫初期便呈现出显著升高的趋势，随着胁迫时间的延长，升高的幅度不断增大。在经过SA处理后，含量均有显著降低，处理前期（T3，5 d）达最低值[0.081 μmol/（g·FW）]。盐胁迫初期电导率随着胁迫程度和时间的延长而呈现出增大的趋势，并在胁迫后期（15 d）达到最大，在经过SA处理后均有不同程度的降低（图2d）。以上结果表明在盐胁迫下，黄连叶片细胞膜透性发生了改變，从而引起部分离子外流，导致电导率发生了变化。在经过Spd处理后，显著地降低了盐胁迫下黄连叶片的相对电导率水平，保护了叶片细胞，维持了细胞膜的相对稳定性。

2.3SA对盐胁迫下黄连幼苗叶片渗透性调节物质含量的影响

从不同处理盐胁迫下黄连幼苗叶片可溶性糖含量的变化趋势（图3a）可看出，可溶性糖含量与对照CK相比，呈现出升高的趋势，且差异显著，但随着NaCl处理时间的延长，可溶性糖含量升高的趋势并不明显；当用外源Spd进行处理后，可溶性糖含量均有不同程度的变化，SA处理随着时间的延长呈现出持续升高的趋势，且在处理后期（10 d），处理浓度为50 mg/L（T3）时达最大值16.90 mg/（g·FW），与盐处理S[13.92 mg/（g·FW）]形成显著性差异。脯氨酸含量的变化与可溶性糖趋势基本一致，均是在未经处理前含量最低，经过盐胁迫后，含量有所增加；但经过外源SA处理后，增加幅度显著提高，使叶片内积累了大量的渗透性物质，以抵抗盐胁迫对叶片造成的伤害（图3c）。可溶性蛋白在盐胁迫下呈现出先升高后降低的趋势，但经过SA处理后，呈现出显著升高的趋势，与盐胁迫处理S相比，差异显著，外源SA有效地减缓了叶片内可溶性蛋白减少的趋势，增加了可溶性蛋白的含量（图3b）。

2.4 SA对盐胁迫下黄连幼苗叶片4种抗氧化酶活性的影响

从图4可以看出，在经过盐胁迫后，4种抗氧化酶的活性均有不同程度的提高，说明黄连幼苗对胁迫的反应比较明显。但4种酶的具体变化规律并不完全相同，在受到盐胁迫后，随着胁迫时间的推移，SOD和APX呈现出先升后降的趋势，而POD和CAT则呈现出持续上升的趋势。在经过外源处理SA后，4种抗氧化酶的活性均呈现出显著升高的趋势，并与空白对照CK和盐处理S形成显著差异，且当SA浓度达50 mg/L（T3）时，其效果最好。SOD、POD、CAT、APX 4种抗氧化酶的活性均在第15天时达最大值，分别为811.01、89.76、9.86和1.75 U/（mg·protein）。说明外源SA显著地提高了4种抗氧化酶的活性，用于减轻细胞氧化程度，维持细胞正常生理活动，且具有一定的持续作用。

3 讨论

盐胁迫导致细胞膜透性增加，质膜透性可以反映植物细胞膜的破损程度，而 MDA 是植物细胞膜脂过氧化作用的最终产物，对细胞膜具有毒害作用，是衡量植物细胞膜脂过氧化程度大小的最常用指标。该试验中，NaCl处理造成黄连幼苗叶片质膜透性和 MDA 含量均高于对照处理，表明盐胁迫能使植物细胞膜脂过氧化作用增强，膜透性增加，加剧植物的氧化损伤。但当用外源SA处理以后，MDA含量显著降低，说明SA对减缓盐胁迫所造成的伤害具有积极的缓解作用，通过外源物质的处理，有效地降低了H2O2含量及O2-·的产生速率，缓解了两者对细胞膜造成的氧化伤害，从而降低了细胞膜的透性。

SOD、POD、CAT和APX 是植物体内酶促防御系统的4个重要保护酶，这些酶类共同作用维持细胞内活性氧代谢的平衡，从而使需氧生物体免受伤害。该研究中，在经过SA处理后，黄连幼苗叶片中4种抗氧化酶均表现出明显的变化，但变化趋势略有不同，说明4种酶在遇到胁迫时具有不同的分工，在经过外源SA处理以后，4种酶的活性大幅度升高以抵抗过氧化对细胞带来的伤害，有效地清除因为膜质过氧化积累下来的活性氧，以实现缓解氧化的目标。该试验结果也证明了外源SA通过诱导抗氧化酶活性来降低活性氧水平，减轻氧化胁迫对黄连幼苗造成的伤害。

SA通常被认为是植物在逆境胁迫反应中产生的一种信号分子，其作用机理之一可能就是SA抑制了MDA累积引起的膜脂过氧化，保护了细胞膜结构的稳定性，这与SA对小麦盐害及水分胁迫的缓解作用机理相似[16]。研究表明，100～200 mg/L的SA在缓解甜瓜盐害中的作用较明显，这与宋士清等在黄瓜幼苗中的研究结果[17-18]相符合。李兆亮等分析发现非盐胁迫下SA对CAT活性有微弱的抑制作用[19]。在该研究中，盐胁迫条件下，外源SA对CAT活性有明显的促进作用，这可能与SA浓度及盐胁迫条件有关。

综上所述，SA通过提高盐胁迫下黄连幼苗的抗氧化酶活性，加强清除活性氧能力，增加膜稳定性，降低细胞渗透势，减少膜质过氧化作用，从而缓解黄连幼苗所受的氧化损伤，增强了其抗盐性。

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