台湾金线莲细胞悬浮培养及其培养条件优化的研究

王晗等

摘要[目的]研究台湾金线莲细胞悬浮培养B5培养基的配方。[方法]以新鲜叶片为材料，经过初代培养、固体培养和继代培养，建立悬浮细胞培养体系，正交设计试验优化培养基配方。[结果]B5培养基中，影响悬浮培养因素的大小依次为大量元素浓度、6BA、2，4D、蔗糖、IAA。[结论]选用2%蔗糖、0.5 mg/L 6BA、0.2 mg/L IAA、0.6 mg/L 2，4D、1/2浓度大量元素的B5培养基培养悬浮细胞，15 d后吸光度达4.425。

关键词台湾金线莲；悬浮细胞；培养基；培养条件；优化

中图分类号S567文献标识码

A文章编号0517-6611（2014）36-12888-02

Abstract [Objective] To investigate B5 medium formula for suspension culture of Anoectochilus frmosanus Hayata cells. [Method] With fresh leaves as material， the culture system of suspension cells was established through primary culture， solid culture and subculture， and culture medium formula was optimized by orthogonal design. [Result] The influence factors of suspension culture in descending order were macroelement， 6BA，2，4D， sucrose， IAA. [Conclusion] The optimum conditions were 2% sucrose， 0.5 mg/L 6BA， 0.2 mg/L IAA， 0.6 mg/L 2， 4D， and semi concentration of macroelement， and culturing with optimal medium after 15 days， the optical density of suspension cells reached 4.425.

Key words Anoectochilus formosanus； Suspension cells； Culture medium； Culture conditions； Optimization

金线莲 （Anoectochilus formosanus Hayata）为兰科（Orchidaceae） 开唇兰属 （Anoectochilus BI） 中小型地生兰，有滋补、止痛、镇咳等功效，可用于治疗肺结核咯血、糖尿病、肾炎、膀胱炎、重症肌无力、遗精、风湿性及类风湿性关节炎、小儿惊风、妇女白带以及毒蛇咬伤等症[1-3]，从金线莲中分离出的金线莲苷（kinsenoside）具抗肿瘤、降血糖等生理活性[4-5]。野生野金线莲主要分布在福建台湾、广东、广西和西藏等地，由于其性喜阴凉、弱光、腐殖质丰富的环境，加上自然的繁殖率低，所以野生资源极其稀缺，而采用大规模的发酵培养，也许是解决这些问题有效的途径之一[6-7]。笔者以新鲜叶片为材料，经过初代培养、固体培养和继代培养，建立悬浮细胞培养体系，正交設计试验优化培养基配方。

1材料与方法

1.1材料

台湾金线莲新鲜叶片采于组织培养瓶中生长旺盛的无菌苗，无菌苗由湖州师范学院生命科学学院实验室提供。试剂除植物激素为生化试剂，其余为分析纯，购于杭州华东医药集团有限公司。

1.2仪器 HZ9310K恒温光照培养摇床、UV1102II紫外可见分光光度计、NIB100倒置显微镜等。

1.3方法

1.3.1台湾金线莲悬浮培养体系的建立。

1.3.1.1初代悬浮培养。

取台湾金线莲叶片，蒸馏水分3次冲洗60 min，酒精70%～75%消毒15～30 s，无菌水冲洗3次，用无菌滤纸吸干材料表面水分后放入研钵中，加入缓冲液（20 μmol蔗糖、10 μmol MgCl2、20 μmol TrisHCl，pH=7.8）研磨数分钟， 61 μm筛网过滤，滤液移入1.5 ml Ep管，离心（5 500 r/min，20 min），沉淀细胞转入B5液体培养基中培养，光照强度1 500～2 000 lx，光照时间16 h/d、温度25±1 ℃、转速120 r/min。

1.3.1.2固体培养。

初代悬浮培养20 d后，取悬浮培养液过61 μm筛网，滤液离心（5 000 r/min， 3 min），沉淀细胞调整细胞密度至104～105个/ml，与40 ℃左右的B5固体培养基摇匀后倒入培养皿中，25 ℃光照培养20 d。

1.3.1.3继代悬浮培养。

挑取固体培养基平板生长良好的细胞团接入液体B5培养基中培养，光照强度1 500～2 000 lx、光照时间16 h/d、温度25±1 ℃，转速120 r/min。

1.3.2台湾金线莲细胞悬浮培养条件的优化。

采用L18（35）正交试验设计[8]，考察B5培养基中大量元素、 蔗糖、吲哚3乙酸（Indole3acetic acid ，IAA）、6苄氨基嘌呤（6Benzylaminopurine， 6BA）、2，4二氯苯氧乙酸（2，4Dichlorophenoxyacetic acid ，2，4D）不同浓度对台湾金线莲悬浮培养的影响，各因素的水平表及试验安排如表1～2所示。取继代细胞接种于100 ml培养基培养15 d后，483 nm波长测定吸光度。按照正交设计试验得到的培养基配方，配制5瓶100 ml培养基，接种培养15 d，验证结果。

效果最好也验证这一点，至于1/4B5培养基效果差，可能与其营养水平过低有关。植物激素对植物细胞生长、分化再生及代谢产物的形成起到了重要的作用，该研究中使用了6BA、IAA 和2，4D 3种激素，研究结果表明激素对细胞生长速度的影响顺序为6BA>2，4D>IAA，其中6BA对生物量的影响仅次于无机盐，说明台湾金线莲生物量的高低与细胞分裂相关度较大。

参考文献

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