PYGM基因SNP及单体型多态性与女子长跑运动员生理表型的关联性

吴剑等

摘 要：目的：探讨PYGM基因SNP及单体型多态性与女子长跑运动员生理表型的关联性。方法：研究对象为我国备战2012年伦敦奥运会国家集训队的79名女子长跑运动员。对PYGM基因的rs483962、rs490980和rs589691 3个位点进行基因型和单体型分析；并研究基因型和单体型与各生理表型指标的关联性。结果：1）rs490980位点不同基因型与运动员O2AT/W显著相关（P<0.05），CC型显著性低于TT型和TC型；rs589691位点不同基因型与运动员WHR显著相关，CC型显著性低于TC型和TT型；2）由rs490980-rs589691位点组成的单体型与WHR显著性相关，TT单体型携带者WHR显著性高于非TT单体型携带者。结论：1）PYGM基因rs490980位点可以作为与有氧运动能力表型有关联性的基因标记； 2）PYGM基因rs589691位点和rs490980-rs589691位点组成的单体型可以作为与身体成分有关联性的基因标记。

关键词： PYGM基因；SNP；单体型；生理表型；关联性研究

中图分类号： G 804.2 文章编号：1009-783X（2014）04-0376-04 文献标志码： A

Abstract：Objective：To explore the association of polymorphisms in PYGM gene with the physiological phenotypes of female long-distance athletes.Methods：We examined the genotypes and haplotypes in SNPs （rs483962，rs490980 and rs589691） of PYGM gene，and used one-way analysis of variance to find the association between the polymorphisms and physiological phenotypes in 79 female long-distance athletes who were preparing for London Olympic Games.Results：The individuals with rs490980-CC genotype had lower O2AT/W than TT and TC.The rs589691 was associated with WHR，those carried CC genotype had lower WHR.The rs490980-rs589691 haplotype was associated with WHR，the individuals with TT haplotype had higher WHR than others.Conclusion：rs490980 may serve as molecular marker associated with aerobic endurance capability phenotypes.rs589691 and rs490980-rs589691 haplotype were associated with body composition phenotypes.

Keywords：PYGM gene； SNP； haplotype； physiological phenotypes； association study

糖原是能量的主要储备形式。糖原磷酸化酶（GP）是糖原代谢过程中的限速酶，使糖原分解释放出1-磷酸葡萄糖（G-1-P）。人类糖原磷酸化酶从20世纪30年代开始一直被研究者重视，根据其功能、结构及组织分布特性主要分为3种亚型，即肌型（Muscle-type GP，PYGM）、肝型（Liver-type GP，PYGL）与脑型（Brain-type GP，BGP或PYGB）[1-3]。肌肉中仅存在M型磷酸化酶，为肌肉收缩提供能量，称为肌肉磷酸化酶（PYGM），而其他组织中含有2种以上的同工酶[4]。肌肉磷酸化酶的主要作用为水解肌糖原支链的α-1，4糖苷键，产物为1-磷酸葡萄糖，后者转化为6-磷酸葡萄糖，进一步生成丙酮酸。有氧代谢时，丙酮酸进入线粒体生成乙酰辅酶A，再通过三羧酸循环产生大量三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）；而无氧酵解时，丙酮酸则生成乳酸和少量ATP[5]。

PYGM基因位于染色体11q12-13.2，由2523个碱基对组成，分为20个内含子和12个外显子[6]。该基因的遗传性缺失可引发一种典型的代谢性肌病—McArdle病，该病的特征为20～30岁起病，表现为运动不耐受、疲劳、肌痛及运动时肌肉痉挛，有时有反复发作的肌红蛋白尿，由此推测其基因多态性可能与运动能力有一定的关联性。

PYGM在肌肉能量代谢中有重要作用，但迄今尚未见其与优秀有氧运动能力表型相关的报道。研究选择优秀长跑运动员作为研究对象，根据以往研究报道及在中国人群中的分布频率，选择位于基因5′端非编码区启动子区域的rs483962和第4、5内含子内的rs490980、rs589691 3个单核苷酸多态位点（single nucleotide polymorphism，SNP）进行基因型分析。这3个位点是位于不同的单体型区块的tagSNP（标签SNP），可以代表不同单体型区块的信息；然后根据PYGM的功能，对研究对象的相关生理表型指标进行测试，以期寻找PYGM基因多态性与优秀有氧运动能力表型的相关性。

2 研究对象与方法

2.1 研究对象

我国备战2012年伦敦奥运会国家集训队的女子长跑运动员79名，分别来自山东、河北、河南、内蒙古和北京共5个省市区专业队， 北京体育大学和北京航空航天大学长跑队，北京远中田径俱乐部女子长跑队。研究对象总人数占2010年我国长跑项目注册运动员总人数的83%，集中了我国目前女子长跑项目成年与青年运动员群体。2010年全国田径锦标赛上获取长跑各单项前8名的运动员中有92%被纳入本研究，基本覆盖了长跑项目全部优秀运动员，运动员基本情况见表1。

2.2 研究方法

2.2.1 表型指标的测定

按照指标所反映的功能，共分为以下2类，采集方法略。

有氧运动能力相关指标：无氧阈摄氧量（O2AT）、相对无氧阈速度（O2AT/W）、无氧阈心率（HRAT）、无氧阈速度（VAT）、最大摄氧量（O2max）、相对最大摄氧量（O2max/W）、无氧阈摄氧量/最大摄氧量（O2AT/O2max）、最大心率（HRmax）、最大跑速（VO2max）；

身体成分相关指标：体脂百分比、身高/体质量百分比、托克来指数、体格指数、体重指数、腰臀比、皮褶厚度总和、肱三头肌处皮褶、肩胛下角处皮褶、腹部皮褶、髂嵴处皮褶、小腿三头肌处皮褶。

2.2.2 基因多态性分析

取5 mL受试者静脉血，收集于抗凝管；Promaga公司基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA；保存于-70 ℃环境中。

采用基质辅助激光解析/电离-飞行时间质谱技术（matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI- TOFMS）对SNP位点进行基因解析。PCR引物和单碱基延伸引物由Assay Designer（Sequenom）软件包设计。所有需要分型的DNA 样本都稀释到5 ng/μL。取1 μL DNA样本，将其与0.95 μL水、0.625 μL PCR缓冲液（含MgCl2 15 mmol/L）、1 μL的dNTP 2.5 mmol/L、0.325 μL的MgCl2 25 mmol/L、1 μL PCR引物及0.1 μL HotStar Taq酶（Qiagen）混合在一起。PCR 反应条件：94 ℃ 15 min；94 ℃ 20 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共45个循环；最终72 ℃ 3 min。PCR扩增后，剩余的dNTP将被去磷酸消化掉，反应体系包括1.53 μL水、0.17 μL SAP缓冲液、0.3U碱性磷酸酶（Sequenom）。该反应在37 ℃进行40 min，然后85 ℃ 5 min使酶失活。碱性磷酸酶处理后，针对SNP的单碱基延伸引物在下列反应体系中进行：0.755 μL水、0.2 μL 10X iPLEX缓冲液、0.2 μL终止混合物、0.041 μL iPLEX酶 （Sequenom），0.804 μL 10 μ mmol/L 的延伸引物。单碱基延伸反应在下列条件下进行：94 ℃ 30 s；94 ℃ 5 s，52 ℃ 5 s，80 ℃ 5 s 5个循环，共40个循环；最后72 ℃ 3 min。在终止反应物中加入6 mg阳离子交换树脂（Sequenom）脱盐，混合后加入25 μL水悬浮。使用MassARRAY Nanodispenser （Sequenom） 将最终的分型产物点样到一块384孔的spectroCHIP （Sequenom）上，并用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱进行分析。最终结果由MassARRAY RT软件系统实时读取，并由MassARRAY Typer软件系统完成基因分型分析。

2.3 数据统计方法

Shesis在线软件对各多态位点进行哈温平衡检验。单个SNP位点不同基因型之间各生理表型指标的差异以表型指标为变量进行单因素方差分析。统计分析由SPSS软件完成，显著性水平定为P<0.05。

Shesis在线软件计算同一基因不同位点间的D′和r2，以度量对应位点间的LD紧密程度，并计算单体型频率。多个位点的单体型分析采用R-平台下的haplo.stat软件。以生理表型指标为变量进行单因素方差分析，统计分析不同单体型与各指标的关联性，统计分析由SPSS软件完成，显著性水平定为P<0.05。人数过低的单体型与相近单体型组进行合并，3种以下单体型的统计分析使用独立样本t检验。

3 结果

3.1 PYGM基因单个位点多态性与生理指标的关联性

分析PYGM基因3个多态位点不同基因型与有氧运动能力指标的关联性，结果显示：rs490980位点不同基因型与运动员O2AT/W显著相关，CC型显著性低于TT型和TC型；rs589691位点不同基因型与运动员WHR显著相关， CC型显著性低于TC型和TT型，见表2。

4 讨论

4.1 PYGM基因与有氧运动能力相关指标的相关性

研究结果显示：PYGM基因rs490980位点不同基因型与运动员O2AT/W显著相关，CC型显著性低于TT型和TC型。

运动员的生理机能一直是长跑项目研究的核心问题，其中有氧运动能力中的O2max、AT和RE被认为是决定运动成绩的3大主要因素[7]。目前大多数研究者认为，运动员有氧耐力的提高并不完全是O2max增长的结果，和AT的提高有密切关系，甚至后者关系更大。有人发现，有氧耐力好的运动员，AT出现得晚。如速度性运动员AT值为50%～60%O2max，而耐力运动员AT值则可为80%～90%O2max[8]。本实验室前期的研究的测试结果页显示：优秀运动员在AT和O2max水平下的多项指标均显著优于一般运动员，与冯美云对2004年奥运会国家集训队的研究结果相一致，证明O2AT能够准确和真实地反映运动员的机能水平。

PYGM是糖原代谢过程中的限速酶，其表达降低会造成糖原代谢障碍，从而影响运动能力。由于未见到国内外对rs490980位点基因型与有氧运动能力表型的相关研究，因此，无法确认其对表型的具体影响。分析认为，该位点位于PYGM基因Intron4位置，内含子为非编码蛋白的序列。近几年的研究发现，内含子是基因组中的一种重要元件，对内含子的功能提出了许多新的见解：内含子在维持染色体的特定结构、基因的特定功能方面有重要作用；内含子在进化过程中通过“外显子改组”的作用在基因的进化中起作用；内含子还对基因的表达起调控作用[9]。本研究认为，rs490980位点多态性可能对PYGM mRNA的表达有一定影响，从而影响了代谢过程，产生了不同基因型O2AT/W的差异性。

4.2 PYGM基因与身体成分相关指标的关联性

研究结果显示：PYGM基因rs589691位点不同基因型与运动员WHR显著相关，CC型显著性低于TT型和TC型；单体型方面，PYGM基因2-3位点单体型与运动员WHR显著相关，TT单体型个体显著性低于非TT单体型个体。

腰臀比（WHR）是腰围和臀围的比值，是判定中心性肥胖的重要指标。腰臀比可作为独立客观反映身体脂肪分布特征的体成分指标：腰臀比越大，体重越大，腹部皮褶越厚；腰臀比增大其血压升高趋势显著，心肺功能也越差；腰臀比增大能使力量、柔韧性、平衡能力、灵敏和反应能力下降[10]。

人体的运动需要能量，机体的新陈代谢过程中，同样也需要能量。细胞代谢直接利用能源来自于ATP的分解产生，ATP的合成需要的能量最终主要是由糖的分解代谢提供。运动中血糖浓度保持相对恒定，随着运动强度的增加，血糖产生与血糖的利用呈平行性变化。运动中肌糖原的分解调节，主要是肌肉收缩，肌细胞内Ca2+浓度增加，Ca2+可以激活磷酸化酶b激酶而提高糖原磷酸化酶的活性，其次是激素尤其是肾上腺素，通过与肌细胞膜的a受体结合，使细胞内的环磷酸腺苷增加，经过一系列的化学变化，导致糖原磷酸化酶的活性升高，促进糖原的分解；因此，PYGM对于机体的糖代谢有重要作用，其活性直接影响集体的新陈代谢过程。

在人类基因组中，相邻近的SNPs等位基因并不是随机组合的，而是倾向于以一个整体遗传给后代，染色体上一系列紧密连锁并共同遗传的遗传标记称为单体型（haplotype）[11-12] 。如果一个单体型有n个变异位点，理论上就可能有2n种可能的单体型；但实际上，大多数染色体区域只有少数几个常见的单体型，它们的模式变化较少且有种族特异性，并且同种族个体中有80%～90%的单体型是一致的，因此，代表了一个群体中的大部分多态性。由于单体型内部紧密连锁且变化较少，因此，可以通过tagSNP代表绝大多数常见的单体型，从而大大降低了SNP分析的数量[13]。

应用tagSNPs构建单体型可以有效地覆盖影响表型的常见单体型。复杂表型一般与多个位点的变异有关，同一个基因上特定等位基因的不同组合对蛋白合成转录水平有不同的影响，因此，单体型分析十分重要。单体型和连锁不平衡分析的方法在医学领域遗传疾病的相关研究中已经被大量应用，在运动分子生物学的研究中也在逐步被引入。本文选择的位于基因第4、5内含子内的rs490980、rs589691 2个位点，是位于不同的单体型区块的tagSNP，可以比较好的代表该区域的分子遗传特征。

研究表明：存在于基因的编码区或非编码区的基因多态位点，可以从功能上直接影响相关基因的表达，也可以与真正的影响功能的基因处于连锁状态，成为有效的分子标记。由于编码区的突变常常会引起蛋白结构的变化，因此，位于编码区非同义突变的多态位点相对较少，而位于非编码区的多态性在基因的表达中起重要调控作用。rs589691位于PYGM基因Intron5，rs490980-rs589691单体型的2个组成位点也均位于PYGM基因的内含子位置，属于基因的非编码区。由此分析上述几个位点可能对基因表达有一定的调控作用，从而影响了PYGM的功能和活性，与身体的能量代谢有一定的关联性；但上述位点的生物学功能和对PYGM基因表达影响的具体机制，还需应用诱导蛋白表达等方法进一步进行研究。

5 结论

PYGM基因rs490980位点CC基因型显著性低于TT型和TC型，可以作为有氧运动能力表型有关联性的基因标记。

PYGM基因rs589691位点CC基因型的WHR显著性低于TT型和TC型；rs490980-rs589691位点TT单体型个体的WHR显著性低于非TT单体型个体，该基因型和单体型可以作为与身体成分有关联性的基因标记。

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