秋水健脾散中β—谷甾醇和鸟苷的HPLC法测定

段伟伟 何胜利

【摘 要】目的：采用HPLC法测定秋水健脾散中β-谷甾醇和鸟苷的含量。方法：Hypersil C18色谱柱（4.6 mm×150 mm，5 ?m）；流速：0.8 mL·min-1；流动相为甲醇-0.2%醋酸（75：25），检测波长：254 nm。结果：β-谷甾醇和鸟苷分别在0.0412～0.8240μg（r=0.9994）、0.0138～0.2840μg（r=0.9995）进样量与峰面积呈良好的线性关系，平均加样回收率分别为96.72%、98.63%，RSD（n=6）分别为1.21%、1.50%。结论：该方法测定结果准确、灵敏、重复性好。

【关键词】秋水健脾散；β-谷甾醇；鸟苷；梯度洗脱法

【中图分类号】R284.1 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484（2014）02-0741-02

秋水健脾散为中药复方制剂，源于卫生部药品标准中药成方制剂第九册，由姜半夏、莲子等十六味药物组成。原质量标准仅对个别药味进行了显微鉴别，未对方中的任何药味进行含量测定，为保证产品质量，确保临床疗效[1-2]，本文采用HPLC法对秋水健脾散中β-谷甾醇和鸟苷进行含量测定，实验结果表明该方法准确、可靠、方便、快速。

1 试药与仪器

LC-10ATVP型高效液相色谱仪；ANASTAR色谱数据工作站；β-谷甾醇对照品（批号为110851-200605）购于中国食品药品检定研究院；鸟苷对照品（批号为110722-200309，纯度≥98%）购于上海医药集团上海化学试剂公司；秋水健脾散（规格：每瓶装3g；批号为130906，1300915，130919）购于泉州中侨（集团）股份有限公司药业公司；甲醇、醋酸均为色谱纯。

2 方法与结果

2.1 β-谷甾醇和鸟苷的含量测定[3-7]

2.1.1 色谱条件及系统适应性

Hypersil C18色谱柱（4.6 mm×150 mm，5 ?m）；流动相为甲醇-0.2%醋酸（75：25）；检测波长：254 nm；流速为0.8 mL·min-1。在此条件下β-谷甾醇和鸟苷与其他组分分离效果良好，以鸟苷计理论塔板数应不低于2000。

2.1.2 对照品混合溶液的制备

精密称取β-谷甾醇对照品和鸟苷对照品各适量，加65%甲醇制成对照品混合溶液（β-谷甾醇为0.0412 mg·mL-1，鸟苷为0.0138 mg·mL-1）。

2.1.3 供试品溶液的配制

取本品适量，研细，取约4.0 g，精密称定，置50mL容量瓶中，加65%甲醇至刻度，超声处理（300W，20kHz）15 min， 用65%甲醇补足减失的重量，摇匀，用微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2.1.4 阴性对照试验

按秋水健脾散处方比例称取适量除姜半夏的其余药味，按秋水健脾散的前处理和制剂生产工艺制成缺姜半夏的阴性样品，按照上述供试品溶液的配制方法制成缺姜半夏的阴性对照溶液。分别精密吸取10 uL的供试品溶液、对照品溶液及阴性对照溶液，按上述色谱条件进行色谱分析，结果供试品溶液色谱中，在与β-谷甾醇对照品和鸟苷对照品相同保留时间处有吸收峰，而阴性对照溶液在相同保留时间处未显吸收峰。

2.1.5 线性关系考察

精密吸取对照品混合溶液1，5，10，15，20 μL，按上述色谱条件进行测定，以峰面积积分值为纵坐标，β-谷甾醇、鸟苷量为横坐标分别绘制标准曲线，得回归方程。β-谷甾醇：Y=1.6891×106X-562.4，r=0.9994；鸟苷：Y=5.0164×106X+169.8，r=0.9995。结果表明β-谷甾醇在0.0412～0.8240μg进样量与峰面积线性关系良好；鸟苷在0.0138～0.2840μg进样量与峰面积线性关系良好。

2.1.6 精密度考察

取对照品混合溶液重复进样6次，按以上色谱条件测定β-谷甾醇和鸟苷的峰面积，结果表明，仪器具有良好的精密度，β-谷甾醇和鸟苷的RSD分别为0.39%、0.42%。

2.1.7 重复性考察

取同一批样品，按上述方法制备6份供试品溶液，分别测定其含量，β-谷甾醇和鸟苷的RSD分别为0.63%、0.66%。结果表明本方法具有良好的重复性。

2.1.8 稳定性考察

取同一供试品溶液，在放置0，1，2，4，6，8 h后精密吸取10 μL进样，测定其峰面积值，β-谷甾醇和鸟苷的RSD分别为0.55%、0.81%，供试品溶液8 h内基本稳定。

2.1.9 加样回收率试验

取已知含量（β-谷甾醇含量0.53 mg·g-1、鸟苷含量0.18 mg·g-1） 的同一批样品适量，研细，取约2.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加对照品混合溶液25mL、65%甲醇25mL，超声处理（300W，20kHz）15 min，， 用65%甲醇补足减失的重量，摇匀，用微孔滤膜滤过，取续滤液，即得加样供试品溶液。精密吸取加样供试液10 μL，按上述含量测定方法测定其峰面积，计算回收率，β-谷甾醇和鸟苷平均加样回收率分别为96.72%、98.63%，RSD（n=6）分别为1.21%、1.50%。结果表明本方法回收率良好。

2.2 样品测定

取3批样品按上述测定方法测定β-谷甾醇和鸟苷的含量，β-谷甾醇分别为0.53、0.47、0.56mg·g-1，鸟苷分别为0.18、0.17、0.21mg·g-1。

3 讨论

检测波长的选择：分别取β-谷甾醇对照品和鸟苷对照品各适量，加流动相溶解制成每1 mL含0.05 mg的溶液，按紫外一可见分光光度法在200～400 nm波长处进行紫外扫描，结果大叶茜草素和羟基茜草素对照品均在254 nm处有最大吸收，故选取254 nm作为秋水健脾散中β-谷甾醇和鸟苷含量测定的检测波长。

参考文献：

[1] 中华人民共和国药典（2010年版一部）[S].2010：218-219，附录30，附录36.

[2] 国家药典委员会.国家药品标准中药成方制剂第九册[S].北京：人民卫生出版社，1998：2.

[3] 修彦凤，杨守娟，张永太.姜半夏质量标准的研究[J].中华中医药杂志，2007， 22（02）：87-89.

[4] 邓然兴，黄儒龙，范宋玲.不同方法炮制姜半夏对β-谷甾醇含量的影响[J].基层中药杂志，2001，15（2）：25-26.

[5] 许卫锋，张保国，李勉，等.半夏、水半夏及其炮制品中β-谷甾醇含量比较[J].河南大学学报（医学科学版），2006，25（3）：29-30.

[6] 祝军委，馮果，冯泳，等.正交设计优选半夏中鸟苷的超声提取工艺[J].河南中医，2013，33（04）：607-608.

[7] 隋利强，吴水生.RP-HPLC法测定不同贮存年限半夏饮片中腺苷和鸟苷的含量[J].黔南民族医专学报，2012，25（03）：157-159.