动物源性食品中美托洛尔和拉贝特罗残留量的测定方法研究

刘思洁 刘晓杰 张博 李青 石矛

【摘 要】目的：建立超高效液相色谱-串联质谱法对动物源性食品中美托洛尔和拉贝特罗残留量的检测方法。方法：以乙腈和含有0.1%甲酸的水为流动相，梯度洗脱，流速为0.3ml/min，柱温45 C，源温度： 110?C，毛细管电压：3.8 kV，在此色谱质谱条件下进行检测。结果：该方法的美托洛尔和拉贝特罗最低定量限为0.4μg/ Kg和0.3μg/ Kg；线性范围为0.1-20.0μg/ Kg， 加标回收率分别为95.2%和80.3%。结论：该方法操作简便，准确，快速，提高了样品检出灵敏度，能够同时检测美托洛尔和拉贝特罗的残留量。

【关键词】美托洛尔；拉贝特罗；超高效液相色谱串联质谱仪；动物源性食品

【文章编号】1004-7484（2014）02-0428-02

β-受体阻断剂是用来治疗高血压等心血管疾病的药物，但是一些不法商贩将其作为镇静剂滥用于动物运输过程中，防治由于动物应激而造成的突然死亡，最常用的β-受体阻断剂是美托洛尔和拉贝特罗。 由于该类化合物大多数是在动物屠宰前使用的，因此该类化合物相对其他的兽医用药可能对消费者造成的健康风险更大[1]，过量滥用该类药物或食用高残留的动物源性食品均会影响人体健康。随着β-受体阻断剂的滥用，其残留引起的影响也引起了广泛的关注，在动物饲养过程中β-阻断剂类药物的使用也都有明确的规定[2]。目前β-受体阻断剂测定的样品大多数为环境样本和尿样，因此建立动物源性食品中美托洛尔和拉贝特罗定性定量检测技术势在必行。

近年来，LC/MS正迅速地成为测定β-受體阻断剂的有效的定性和定量手段[3-4]。本文建立的超高效液相色谱-串联质谱法检测β-受体阻断剂美托洛尔和拉贝特罗是针对我国食品安全中最为突出的问题和检测常见的污染物所急需的检测方法，解决了食品安全的关键技术。

1 材料与方法

1.1 仪器 超高效液相色谱-串联质谱仪；离心机；氮吹仪；固相萃取（SPE）小柱（6ml，200mg）。

1.2 试剂 甲醇（色谱纯）；乙酸乙酯（优级纯）；乙腈（色谱纯）；甲酸（纯度为99%，），浓高氯酸（优级纯）；氢氧化钠（优级纯）；β-葡萄糖苷酸酶/芳基硫酸酯酶（116400unit/mL）；浓氨水（优级纯）；水为GB /T 6682 规定的一级水。

1.3 标准物质：美托洛尔（metaprolol）、拉贝特罗 （labetalol），纯度均大于95%。

1.4 标准储备液配制 分别称取美托洛尔和拉贝特罗10.0mg置于10ml棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容，于4℃条件下保存。根据需要吸取混合标准储备液，用基质溶液稀释配制成适当浓度的混合标准工作液。

1.5 样品前处理

样品经绞碎混合均匀后，准确称取5.0g，置于50mL离心管中，加入0.2mol/L醋酸-醋酸钠缓冲溶液（pH=5.2）10mL，加入50μL的β-葡萄糖苷酸酶/芳基硫酸酯酶，60℃水解3小时，超声提取10min后10000r/min 离心10min。沉淀再用10mL 1.0mol/L高氯酸溶液提取一次，合并两次提取液。用1mol/L的NaOH调pH=4.0，以10000r/min冷冻离心，上清液待净化。

MCX柱依次用6ml甲醇、6ml水活化后，加入上述溶液过柱，弃去过滤液。依次用6ml的0.1mol/L醋酸、6mL甲醇淋洗，弃去过滤液和淋洗液，再用6mL的5%醋酸乙酯一氨水溶液洗脱，收集洗脱液于玻璃小瓶中，氮气吹干，用5mL0.1%甲酸水定容，经0.22μm微孔滤膜过滤，UPLC-MS/MS测定。

1.6 色谱质谱条件

1.6.1 超高效液相色谱条件 色谱柱：Waters ACQUITY UPLCTM BEH Shield RP 18 柱（100 mm×2.1 mm i.d.， 1.7μm），柱温：45℃，进样体积：2μl；流动相A为含0.1%的甲酸水，流动相B为乙腈，流速为0.3ml/min。线性流动相梯度洗脱条件见表1。

2 结果与讨论

2.1样品前处理条件的选择

2.1.1 酶解和酸解

β-受体阻断剂在组织中往往与其他成分形成结合物，如与葡萄糖苷酸酶、硫酸酯蛋白相结合，所以样品提取时需用酸或酶水解。对于固体组织样品，蛋白水解酶消化法能有效释放与细胞成分结合的β-受体阻断剂和改善提取效率，因此本方法选择用β一盐酸葡萄糖醛甙酶/芳基硫酯酶进行水解。由于β一盐酸葡萄糖醛甙酶/芳基硫酯酶在pH 5.2时的活性最佳，所以本方法采用在pH 5.2的醋酸铵缓冲液中进行。

2.1.2 固相萃取柱的选择

SPE是对β-受体阻断剂最有效的净化方法，对美托洛尔和拉贝特罗均有良好的适用性。由于在pH 5.2时，美托洛尔和拉贝特罗为解离形式，本方法选择阳离子交换柱，将样品加至活化后的SPE柱上，用醋酸溶液和甲醇依次淋洗后，用氨甲醇溶液使美托洛尔和拉贝特罗呈非解离态后洗脱。本方法比较了C柱、MCX柱、C 柱和MCX柱串联和PCX柱。C柱和MCX柱串联与单独用MCX柱无明显差异；MCX柱比PCX柱有更好的效果。

2.2 质谱条件的优化

采用流动注射泵连续进样， 对美托洛尔和拉贝特罗的质谱条件进行优化， 在正离子和负离子模式下进行了全扫描， 结果表明：在正离子模式下，美托洛尔和拉贝特罗全扫描的分子离子[M+H]+最理想。同时分别对1.0μg/mL的单个标准溶液进行分子离子全扫描，然后以分子离子为母离子（分别为268.3和329.2），对其子离子进行全扫描（分别为116.1和311.3），并优化得到美托洛尔和拉贝特罗的母离子和子离子所需的最佳锥孔电压为35 V和28 V，碰撞能量为18eV和25eV。最后，以多反应监测（ MRM） 方式对美托洛尔和拉贝特罗进行扫描。美托洛尔和拉贝特罗标准色谱图见图1。

图1 美托洛尔（A）和拉贝特罗（B）标准色谱图

2.3 色谱条件的优化

由于电喷雾质谱的离子化是在溶液状态中电离，因此流动相的组成和添加剂除了影响目标化合物的分离（保留时间和峰形）外，还会直接影响到目标化合物的离子化效率，从而降低目标化合物的检测灵敏度。分别采用甲醇-0.05%甲酸水、乙腈-0.05%甲酸水、乙腈-0.2%甲酸水、甲醇-0.1%甲酸水、乙腈-0.1%甲酸水作为流动相考察了不同有机相组成对离子化的影响，同时比较了水相中不同甲酸含量（0.1%～0.2%）对灵敏度的影响。实验表明以乙腈-0.1%甲酸水作为流动相的灵敏度明显高于以甲醇-0.1%甲酸水作为流动相的灵敏度。不同水相的结果比较表明，0.1%的甲酸添加量的灵敏度高于其他浓度，低于 0.1%电离程度不足，而高于 0.1%可能会导致离子抑制效应，反而降低了灵敏度，因此，方法选用了乙腈和 0.1 %甲酸水溶液作为流动相。

2.4 线性范围、检出限、定量限

美托洛尔和拉贝特罗在 0.1μg/kg-20μg/kg具有很好的线性关系，相关系数R2均大于 0.99。以信噪比为3时的空白样品基质加标的含量为方法的检出限，信噪比为10的空白样品基质加标的含量为定量限。美托洛尔和拉贝特罗的检出限均能达到0.1μg/kg，最低定量限为 0.4μg/kg和0.3μg/kg。

2.5 加标回收实验

在猪肉、牛肉中分别进行三个浓度 0.2，1.0， 5.0 μg/kg，六个平行的加标实验。美托洛尔和拉贝特罗的加标回收率为 95.2%和80.3%，相对标准偏差为 7.4%和9.5%。

本研究建立了动物源性食品中美托洛尔和拉贝特罗定性定量检测技术，用所建立的方法对市场上猪肉、牛肉、羊肉、猪肝、猪肾等动物源性样品进行检测，均取得了满意的测定结果。本方法解决了食品安全中β-受体阻断剂美托洛尔和拉贝特罗检测的关键技术。

参考文献：

[1] 吴永宁，苗红、范赛等. 高效液相色谱——线性离子肼质谱法测定畜禽肌肉中β2-受体激动剂和β-受体阻断剂类药物残留[J]. 中国科学 B辑： 化学，2009，39（8）：774-784.

[2] 吴永宁， 邵兵， 沈建忠. 獸药残留检测与监控技术-食品安全关键技术系列图书. 北京：化学工业出版社， 2007. 615.

[3] 范赛，邹建宏，苗虹等. 液相色谱-三级质谱法分析尿液中β2-受体激动剂和β-受体阻断剂多组分残留[J].分析化学，2011，39（8）：1153-1158.

[4] 蔡增轩，贾晓飞，潘红峰等. 超高效液相色谱-电喷雾串联四极杆质谱法检测动物组织中20种β2-兴奋剂残留[J]. 中国卫生检验杂志，2009，19（11）：2461-2464.