无籽沙糖橘CrS1—1基因的克隆与表达分析

吴秀兰 何思欣

摘 要 为研究显花植物自交不亲和的分子机理，以无籽沙糖橘为试材，克隆无籽沙糖橘花粉S1基因的cDNA和DNA全长序列，命名为CrS1-1，该基因cDNA和DNA全长均为450 bp。半定量PCR分析结果表明，该基因在花粉中特异表达。Real-time PCR分析表明，该基因在无籽沙糖橘自花授粉72h表达量达到最大，而无籽沙糖橘×有籽沙糖橘异花授粉72 h的表达量最低。

关键词 无籽沙糖橘；自交不亲和性；CrS1-1；表达分析

中图分类号 S666 文献标识码 A

Cloning and Function Analysis of CrS1-1 Gene in

Citrus reticulata Blanco cv. Wuzishatangju

WU Xiulan*， He Sixin

College of Life Science， Zhaoqing University， Zhaoqing， Guangdong 526061， China

Abstract In this study， the full-length sequences of cDNA and DNA of CrS1-1 gene were obtained from a mandarin Wuzishatangju（Citrus reticulata Blanco）. The length of cDNA or DNA is 450 bp. Tissue-specific expression of CrS1-1 was detected using semi-quantitative RT-PCR and quantitative real-time PCR. CrS1-1 expressed exclusively in anthers. When 'Wuzishatangju' was self-pollinated， the expression level of CrS1-1 in pistils reached a maximum at 72 h， and decreased thereafter. While in cross-pollination of‘Wuzishatangju× ‘Shatangju， the expression was very weak at 72 h.

Key words Wuzishatangju； Self-incompatibility； CrS1-1； Expression analysis

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.08.020

植物自交不亲和性（Self-incompatibility，SI）是显花植物为防止近亲繁殖、促进异花授粉而形成的一种机制，是分子生物学的研究热点之一。根据遗传背景可将SI分为配子体自交不亲和（Gemetophytic self-incompatibility，GSI）和孢子体自交不亲和（Sporophytic self-incompatibility，SSI）。果树自交不亲和大多属于GSI自交不亲和，主要由花柱S-RNase基因和花粉F-box基因关键因子决定[1-6]。除了花粉和花柱关键因子外，还有很多非关键因子，如钙结合蛋白（CaBP）[7-8]、泛素结合蛋白（actin-bing proteins）[9]、锌指蛋白（Zinc-finger protein）[10]、HT-B[11-12]、γ-硫堇（γ-thionin，MdD1）[13]、S1 Protein等[14]可能也参与自交不亲和反应。这些非关键因子在花粉和花柱相互识别过程中，可能起到识别和降解S-RNase、细胞信号转导、调节花粉管生长等作用，最终由关键因子与非关键因子共同作用而导致自交不亲和的发生[6，11，15-16]。Foote等[14]通过虞美人（Papaver rhoeas L.）离体及活体花粉萌发试验，发现S1蛋白可以抑制S1基因型的花粉萌发，而不能抑制非S1基因型的花粉萌发，认为S1蛋白参与了自交不亲和性反应。但在柑橘研究中，关于S1蛋白在自交不亲和反应中的作用尚未见报道。本研究以无籽沙糖橘成熟花粉为试材，克隆无籽沙糖橘S1基因cDNA和DNA的全长序列，命名为CrS1-1。并分析了该基因在不同组织器官、自交及异交授粉后不同时段的表达特性， 为研究S1蛋白在自交不亲和反应中的作用及柑橘选育奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料由华南农业大学提供，于2012年春季取无籽沙糖橘7个器官（芽、叶、花粉、花丝、柱头、花柱、子房），以及无籽沙糖橘自交授粉、无籽沙糖橘×有籽沙糖橘异花授粉后不同时段（0、12、24、48、72、96、120、144 h）的雌蕊。所有材料液氮速冻后，于-80 ℃保存。

1.2 方法

1.2.1 总RNA、基因组DNA的提取及其cDNA第一链的合成 基因组DNA提取采用CTAB法[17]，并略加改进。总RNA提取采用天恩泽公司的Column Plant RNAOUT试剂盒进行，并用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测。cDNA第一链合成参照Life Technology公司生产的M-MLV反转录试剂盒进行。RNA酶抑制剂（RNase Inhibitor）及DNase I（RNase Free）购于TaKaRa公司。

1.2.2 S1基因的克隆 S1采用3′和5′RACE法克隆：根据华中农业大学甜橙基因组S1（Cs8g11080）序列，分别设计特异引物S1-3′ RACE和S1-5′ RACE（表1）。严格按照Clontech公司SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit操作说明进行。用Agarose Gel DNA Extraction Kit（TaKaRa）回收PCR产物，连接到pMD19-T vector（TaKaRa）克隆载体，转化至大肠杆菌DH5α菌株，PCR检测并酶切鉴定后送北京华大基因（BGI）公司测序。

S1基因cDNA全长克隆：利用生物软件DNA Man将5′ RACE、3′ RACE测序结果，以及甜橙Cs8g11080序列进行拼接，并用ORF Finder（Open Reading Frame Finder）进行ORF预测。设计包含起始密码和终止密码的上、下游引物S1-F和S1-R（表1），对预测ORF进行验证。以花粉cDNA为模板，进行PCR扩增，反应体系为10×PCR buffer 5.0 L，dNTP 1.0 L，上下游引物各0.5 L，模板cDNA 1 L，ExTaq 0.5 L，加ddH2O至总体积50 L。PCR扩增程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，70 ℃延伸90 s，30个循环；72 ℃延伸10 min。回收、转化及测序同上。

S1基因组DNA全长的克隆：方法与扩增cDNA全长相同。

通过NCBI中BLASTx进行S1蛋白同源性搜索与比对，利用Clustal X软件进行同源性分析，使用MEG 5软件UPGMA法构建系统发育树。

1.2.3 实时荧光定量PCR分析 利用TOYOBO公司的7300 Real-time PCR扩增仪器进行实时定量PCR试验，荧光染料试剂盒用SYBR Premix Ex Taq。以反转录得到的cDNA用于Real-time PCR分析，引物为QS1-F和QS1-R（表1）。以ACTB为内参引物（表1）。扩增体系为20 μL：SYBR Green Real-Time PCR Master Mix 10 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，模板cDNA 20 ng，加ddH2O至20 μL。Real-time PCR扩增程：94 ℃ 2 min；94 ℃ 10 s，58 ℃ 15 s，72 ℃ 35 s，40 cycles，每次循环在第3步采集荧光。内参基因和待测基因均设置3次重复。

2 结果与分析

2.1 RNA的提取和cDNA第一条链的合成

采用柱式植物RNAout（TIANDZ）提取无籽沙糖橘花器官总RNA后，取5 μL点样于1.2%的琼脂糖凝胶中进行电泳检测。结果见图1。从图1可以看出，28S RNA与点样孔之间无明显亮带，说明无DNA污染；28S RNA和18S RNA条带清晰明亮，并且5S RNA可见，说明提取的总RNA完整，无降解，适宜进行后续的cDNA第一条链的合成。

2.2 S1基因的克隆与序列分析

根据S1基因（Cs8g11080）序列设计的特异引物S1-3′ RACE和S1-5′ RACE，进行PCR扩增（图2-A、B），克隆测序后分别得到486 bp的3′ 端（图2-A），以及366 bp的5′ 端（图2-B）序列。将克隆得到RACE序列与Cs8g11080中间序列进行拼接，得到450 bp（图2-C），该序列含起始和终止密码子的S1 ORF。根据拼接所得序列，设计特异引物S1-F和S1-R进行PCR扩增（图2-D），克隆测序后获得长度为450 bp序列（表2），经比对后，发现该序列与拼接序列相一致。通过NCBI在线比对，发现该序列与其他植物的S1基因序列具有较高的同源性，可以确定所获得的基因为柑橘花粉S1基因家族中的一员，命名为CrS1-1。

ORF Finder分析表明，CrS1-1基因包含一个450 bp的完整开放阅读框，编码一个含149个氨基酸的蛋白质（表2），推定的分子量为18.13 ku，理论等电点为6.19。

2.3 CrS1-1系统进化树分析

利用NCBI对CrS1-1氨基酸序列进行同源性比对，结果见图3。由图3可知，CrS1-1基因编码的蛋白与甜橙S1蛋白（Cs8g11080）同源性最高，达到99%。其次是拟南芥S1蛋白（NM00112557），同源性为78%。

2.4 半定量与Real-time PCR表达分析

利用半定量和定量PCR对CrS1-1在无籽沙糖橘不同组织器官，以及自交和异交后不同时间段雌蕊的表达特性进行了分析。结果表明，该基因在芽、叶、花粉中均有表达，其中花粉的表达量最高，为特异性表达。在花柱、花丝、柱头、子房中基本不表达（图4-A）。Real-Time PCR分析结果见图4-B，由图4可知，该基因在花粉中表达量最高，达到10.62，而在子房中的表达量最低，仅为0.21，不同器官的表达水平排序分别为花粉>叶>花柱>柱头>芽>花丝>子房。其结果与半定量结果基本一致。

由于CrS1-1在花粉中特异性表达，为研究该基因授粉后的表达情况，检测了无籽沙糖橘自花授粉、无籽沙糖橘×有籽沙糖橘异交授粉后8个不同时间段的基因表达水平，Real-time PCR结果见图5。雌蕊中无籽沙糖橘自交授粉后0 h基本不表达，12 h到24 h表达量上升，48 h到72 h迅速上升，3 d之后有迅速下降，6 d后表达量降到很低。而在无籽沙糖橘×有籽沙糖橘异交授粉后0 h到48 h呈下降表达，72 h表达量迅速下降，之后缓慢上升。

3 讨论与结论

自交不亲和性是显花植物为防止近亲繁殖、促进异化授粉而形成的一种机制。研究结果表明，自交不亲和性反应是一个多基因协同作用的复杂过程，在模式植物中，除花柱S-RNase和花粉F-box基因（SLF/SFB）2个自交不亲和反应关键决定因子外，还有非关键因子如：钙结合蛋白、泛素、S1蛋白自交不亲和蛋白等也参与其中[4，9，12]。Ye等[18]发现无籽沙糖橘的阻抑部位在子房，其表现是无籽沙糖橘自交72 h时花粉管在子房内部开始自身盘绕生长，无法接近胚珠，并且向着远离胚珠的子房底部盘绕生长。随后Miao等[19]对S-RNase进行了研究，发现S-RNase在无籽沙糖橘自交后72 h表达量达到最高，120 h以后迅速递减，168 h几乎不表达，而该基因在无籽沙糖橘异交后72 h几乎不表达，这与细胞学上观察到无籽沙糖橘自交后72 h出现花粉管卷曲，异交后72 h花粉管正常生长的时间相吻合。

本研究无籽沙糖橘花粉中克隆到一个自交不亲和CrS1-1基因，半定量PCR结果表明，CrS1-1基因在无籽沙糖橘上具有明显的组织器官表达特异性，与成建红等[20]在樱桃上报道花粉关键基因PaSFB9基因具有组织器官特异性表达结果一致，也与蔷薇科果树扁桃（Prunus dulcis）[21]、甜樱桃（P. avium）[22]和苹果（Malus×domestica）[23]等植物花粉SFB/SLF基因的表达特异性一致。Real-time PCR进一步发现该基因在花粉中表达量明显高于其它部位，约为叶片的5倍、芽的9倍。无籽沙糖橘自交不同时段Real-time PCR分析表明，无籽沙糖橘自交后72 h表达量达到最高，96 h后迅速递减，144 h表达量很低；无籽沙糖橘×沙糖橘异交后不同时段Real-Time表明异交后72 h表达很低。这与无籽沙糖橘S-RNase自交及异交不同时段不同组织表达结果相一致，也与细胞学上观察到无籽沙糖橘自交后72 h出现花粉管卷曲而异交后72 h花粉管正常生长的时间相吻合[18-19]。推测CrS1-1基因参与了关键因子自交不亲和反应，从而抑制了花粉管的正常生长导致花粉管出现卷曲，不能到达胚珠完成正常的授粉受精过程，形成无籽果实。但CrS1-1如何参与关键因子进行自交不亲和反应仍需进一步研究。

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责任编辑：赵军明