鸳鸯茉莉不同发育时期POD同工酶体系优化

陈小琴等

摘 要 以不同花色、不同发育时期的鸳鸯茉莉（Brunfelsia acuminate Benth.）花瓣为材料，通过单因素试验方法，分别以不同浓度及pH值的Tris-HCl和磷酸缓冲液（PBS），获得提取花瓣中过氧化物酶（POD）的最佳浓度和pH值，并对不同花色、不同发育时期花瓣的POD活性进行测定。结果分别选出0.4 mol/L Tris-HCl，pH7.0和0.1 mol/L PBS，pH7.0 2种缓冲液组合，其中以后者的提取效果最好，并通过POD同工酶谱得以证明；不同发育时期POD活性：白花>淡紫花>紫花，花瓣颜色褪变与POD活性呈正相关，且差异均达显著水平（p<0.05）；花瓣中不同形态的POD活性之间差异显著，可溶态POD活性远大于结合态的POD活性。

关键词 双色茉莉；过氧化物酶；同工酶；体系优化

中图分类号 S682.3 文献标识码 A

POD Isozyme System Optimization of Brunfelsia acuminate

（Solanaceae）in Different Development Stages

CHEN Xiaoqin， GUO Zhixiong， LIN Lin， WANG Bei， KE Yiyong

WU Jialing， PU Xiaolong， FU Lihong， PAN Dongming*

Institute of Storage Scienci and Technology of Horticultural Products， Fujian

Agriculture and Forestry University， Fuzhou， Fujian 350002， China

Abstract The petals of Brunfelsia acuminata Benth during development stages were used to determine POD activity through single-factor experiment design with different concentration and pH value of Tris-HCl and PBS buffers in the extraction of petal POD to obtain the optimal combination. The results showed that： Among the selected buffers 0.4 mol/L Tris-HCl（pH7.0）and 0.1 mol/L PBS（pH7.0）， he latter was better， which could be confirmed by POD isoenzyme spectrum； POD activity in different development stages was as follows： white > mauve > purple， and POD activity was positively related with the petal color fading with an extremely significant level（p<0.05）； The POD activity of different forms in petals varied considerably； The soluble POD activity exceeded the conjuncted one.

Key words Brunfelsia acuminata； POD； Isoenzyme； System optimization

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.08.011

花色苷（Anthocyanins）作为负责颜色从红到紫和蓝的最大色素群[1]，主要分布在花朵、果实和叶子的表皮细胞或皮下细胞的液泡中，是影响植物色彩表达的主要因素之一[2]。同时，花色苷作为植物生长、发育期间响应外界环境变化而产生的次生代谢产物之一[3]，其生物合成与体内降解机理的阐释对其生理生态功能的揭示有着重要意义[4]。对于花色苷的生物合成与代谢途径，生物化学家已进行了较为详细的研究[5-6]。

与花色苷合成途径方面的深入研究相比，花色苷降解及降解处理方面还知之甚少[7]。花色苷降解分为体外（in vitro）、体内（in vivo）降解，分别受不同因素影响[4]。有报道称，花色苷的体外降解受理化因子制约[8-10]，它的积累、颜色表现及其稳定性很大程度受多种因素影响，比如自身化学结构和浓度、金属离子络合、类黄酮浓度、pH条件[11]、温度和光、辅助色素、酶、氧等[8]。而其体内降解过程至今仍鲜有了解[4]。有研究认为，花色苷的体内降解应是在多种酶催化下完成的[4]，这些酶主要包括β-糖苷酶（β-Glycosidases）、多酚氧化酶（PPO）、过氧化物酶（POD）[12-13]。其中，POD是高等植物体内重要的代谢酶，参与植物体内重要的生理活动，与植物的抗性有密切的关系。

在水果研究中发现，POD是能使花青素减少的酶[14]。在葡萄酒及葡萄汁的相关研究显示，花色苷降解和POD具有相当的关系[7]。此外，在荔枝采后褐变过程中，已被证明花色苷的降解与POD活性的逐渐升高相关[15]。从POD对花色苷的降解机理来看，花色苷不能直接作为POD的底物[4]。与PPO一样，POD也不能直接氧化降解花色苷，类似报道还见于葡萄[16]和荔枝[17]等果实，POD均不能直接氧化其花色苷，但花色素却能作为POD的底物[16-17]。

鸳鸯茉莉（Brunfelsia acuminata Benth.）属茄科（Solanaceae）鸳鸯茉莉属，原产巴西。花开放2～5 d，颜色从深紫变为白色，这个过程始于花瓣衰老之前进行[1]。因开花时间不同，所以在同一植株上能同时看到各种不同颜色的花朵，形成独特的景观效果，具有极高的观赏价值。研究表明，大花鸳鸯茉莉（Brunfelsia calycina Benth.）花瓣中的花色素主要由锦葵素（Malividin）、矮牵牛素（Petunidin）、花翠素（Delphinidin）组成， 且这些花色素的合成终止于花朵开放之前，之后随着花朵开放花色变浅，花色素含量不断下降[7]。并已证实这种现象的产生，是由于POD的作用下发生氧化反应而导致花瓣中花色素苷的降解，这个过程需要新mRNA和蛋白质的合成，表明POD确实参与花色苷的体内降解，且这一降解先于衰老过程，是另一个具特征性、专一性的途径[4]。Oren-Shamir也认为POD和花色苷酶参与了鸳鸯茉莉花色苷的降解[3]。

目前，关于花色苷的体内降解机制迄今仍不太清楚。虽有研究显示，花色苷酶（Anthocyanase）、PPO、POD和果胶酶（Pectinase），是参与降解花色苷的主要酶[4]。这在理论上有助于花色苷体内降解机理的解析，实践上从控制酶活角度来促进或防止、稳定花色苷的降解提供了依据[4]。而POD参与鸳鸯茉莉花色苷降解的生理生化及分子机制方面研究还鲜见报道。本试验基于POD的角度，主要探讨不同pH值及浓度的Tris-HCl和磷酸盐缓冲液（PBS）对不同发育时期不同花色鸳鸯茉莉中POD活性变化的影响，为下游鸳鸯茉莉中POD的分离纯化提供参考，为进一步探讨鸳鸯茉莉POD参与花瓣中花色苷降解代谢的机制奠定研究基础。

1 材料与方法

1.1 材料

鸳鸯茉莉（Brunfelsia acuminate Benth.），于2013年4月18日取自福建农林大学作物学院旁，随机采取东、南、西、北4个方向生长健壮、花色正、花型一致的盛开花朵，取花瓣。具体花色如图1，每种颜色（深紫、淡紫、白色）各称取0.20 g（精确到0.01）。

1.2 方法

1.2.1 Tris-HCl体系优化 用不同浓度（0.1、0.2、0.3、0.4 mol/L）及pH值（6.0、6.5、7.0、7.5、8.0）的Tris-HCl缓冲体系。单因素试验：先在0.1 mol/L Tris-HCl浓度下，通过测定POD的活性，比较以上5个pH值梯度下Tris-HCl的提取效率，从中筛选出该浓度下Tris-HCl的最佳pH值。再比较不同浓度（0.1、0.2、0.3、0.4 mol/L）的Tris-HCl提取花瓣的POD活性。最终获得Tris-HCl体系提取的最佳pH值和最佳浓度。重复3次。

1.2.2 PBS体系优化 取不同浓度（0.05、0.1、0.15、0.2 mol/L）和pH值（5.8、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0）的PBS缓冲体系，重复3次。具体试验步骤同上。

1.2.3 不同结合状态的POD活性比较 不同结合状态POD的提取参照Lee等[18]并加以改进。

可溶态POD提取：取花瓣研究方法0.2 g，加入含0.1 mol/L Tris-HCl，pH6.8（1 ∶ 3 W/V）提取缓冲液，并放置冰上浸提2 h，每20 min用涡旋振荡器摇15 s。12 000 ×g，4 ℃，5 min，取上清，沉淀再用提取缓冲液洗3次。

结合态POD提取：将上一步得到的沉淀细胞壁蛋白质，用600 μL，0.1 mol/L Tris-HCl（含1 mol/L NaCl），pH 6.8提取液。室温下，振荡提取2 h。12 000 ×g，4 ℃，5 min，取上清液，即为结合态POD。

1.2.4 POD活性测定 参照愈创木酚比色法[16]加以改进。加入1 mL POD反应液（0.1 mol/L，pH6.8 PBS，含0.125% H2O2 和0.2%愈创木酚（V/V）；最后加入粗酶液（紫色50 μL、淡紫花10 μL、白花5 μL）启动反应，在可见光光度计470 nm下测其吸光值变化，反应2 min，每5 s取值1次。将每分钟OD增加0.01定义为1个活力单位。POD活性单位（U/g FW）。

1.2.5 POD同工酶电泳 采取聚丙烯酰胺凝胶电泳，参考车建美等[19]研究的方法。染色方法采用醋酸-联苯胺染色法[20]。

1.3 数据分析

采用SPSS20.0软件进行单因素方差（One-WayANOVA）分析，结合LSD与Duncan法，经方差分析和多重比较计算。

2 结果与分析

2.1 Tris-HCl对POD活性的影响

2.1.1 0.1 mol/L Tris-HCl的最适pH值确定 由图2可知，紫花、白花的表现变化趋势相同，整体呈先上升后下降，POD活性在pH7.0时为最高；紫花的POD活性，除与pH7.5相比无显著性差异外，比其余pH时的活性明显增高，达显著水平（p<0.05）（图2-A）；白花的POD活性在不同pH组间差异均不显著（图2-B）。因此，在0.1 mol/L浓度下，最适pH为7.0。

0.1 mol/L Tris-HCl pH7.0时，白花、紫花的POD单位酶活分别为293.23、14.12（U/g FW）。2色花之间的POD活性差异极显著（p<0.01），白花是紫花的20倍。说明白花的POD活性最大。

2.1.2 pH7.0 Tris-HCl的最适浓度筛选 由图3可知，紫花、白花的POD活性均随Tris-HCl浓度的升高而增强，在0.4 mol/L时达最高。紫花在Tris-HCl浓度为0.4 mol/L时与其它浓度达显著性差异（p<0.05）；白花在Tris-HCl浓度为0.1 mol/L时与其它浓度达显著性差异（p<0.05）。

对不同的pH值及浓度Tris-HCl的单因素试验结果可知，0.4 mol/L、pH7.0 Tris-HCl可作为进一步试验的最佳提取液。

2.2 PBS对POD活性的影响

2.2.1 0.05 mol/L PBS的最适pH值确定 由图4可知，紫花、白花pH>7.0的PBS POD活性均明显增强，紫花pH 8.0与pH 5.8、pH 6.5的POD活性差异显著（p<0.05），其余差异不明显；白花pH7.0、pH7.5与pH5.8、pH6.0、pH6.5对POD活性的影响差异显著（p<0.05）。因此，0.05 mol/L PBS的最适pH为pH7.0。

2.2.2 pH7.0时PBS的最适浓度筛选 由图5可知，紫花、白花的POD活性均呈先升后降；紫花在PBS浓度为0.1和0.15 mol/L与0.05 mol/L达差异显著（p<0.05）；白花在PBS浓度为0.05 mol/L与其他浓度差异显著（p<0.05）。由于PBS浓度越高，越会产生盐析现象，而导致POD的溶解度下降。因此，以浓度0.1 mol/L pH7.0 PBS作为下一步体系优化试验。

2.3 进一步比较Tris-HCl和PBS对POD活性的影响

对Tris-HCl和PBS缓冲体系优化的单因素试验结果可知，0.4 mol/L，pH 7.0 Tris-HCl与0.1 mol/L，pH7.0 PBS对不同花色鸳鸯茉莉花瓣中POD提取效果均较好，进一步研究比较二者对POD活性的影响（图6）。由图6可知，随着花瓣颜色褪去，POD活性不断增强；白花的POD活性最大，3种颜色花之间的POD活性差异显著（p<0.05）；用Tris-HCl（0.4 mol/L，pH7.0）和PBS（0.1 mol/L，pH7.0）缓冲体系，都能较好提取紫花、淡紫花中的POD，二者差异不明显，而对白花POD活性的影响差异达显著水平（p<0.05）。因此，PBS（0.1 mol/L，pH7.0）提取效果较好。

2.4 Tris-HCl和PBS对POD同工酶的影响

将体系优化获得的Tris-HCl（0.4 mol/L，pH7.0）和PBS（0.1 mol/L，pH7.0）2个缓冲液，对3种颜色6个样本的鸳鸯茉莉进行POD同工酶电泳分析，其电泳图及相应的迁移率模式图7A～B可以看出：2种缓冲液提取的同工酶谱都较为清楚，但用PBS提取白花，POD酶谱条带（图7A-6）更粗且更加明显。因此，2种缓冲体系对鸳鸯茉莉花瓣中POD活性的提取效果均较好，但考虑白花的POD活性及今后对POD的进一步纯化，以PBS（0.1 mol/L，pH7.0）提花瓣中的POD效果更佳。根据相对迁移率的不同，计算鸳鸯茉莉POD同工酶所有的扩增酶带数，共找到6条（图7A：abcdef），迁移率依次为0.044 1、0.161 8、0.274 5、0.328 4、0.5、0.519 6。从紫花到白花的变化，POD活性是上升的，如图7A（a、e）所示的2条特征酶谱，POD活性明显增强。

2.5 不同结合状态的POD活性比较

由图8可知，3种颜色花的可溶态POD活性的变化，随缓冲液洗脱次数的增加而明显下降，白花、淡紫花、紫花第一次到第二次洗脱下降幅度分别是239.1%、197.2%、94.2%；POD活性下降幅度大小依次是白花>淡紫花>紫花，白花可溶态POD活性由第一次590.3（U/g FW）降至174.1（U/g FW）。而结合态POD，无论是从哪种花色提取得到的，活性都非常低，说明结合态的POD在鸳鸯茉莉花瓣中含量都很低。

3 讨论与结论

3.1 鸳鸯茉莉花瓣中POD同工酶体系的建立

鸳鸯茉莉花瓣POD同工酶提取的体系优化结果：研磨时加入20% PVPP，0.4 mol/L，pH7.0 Tris-HCl和0.1 mol/L，pH7.0 PBS提取效果均较好（紫花、淡紫花），但白花以0.1 mol/L pH7.0 PBS为宜。采取聚丙烯酰胺凝胶电泳法，醋酸-联苯胺染色法进行同工酶的染色。

3.2 鸳鸯茉莉花瓣中POD存在的主要状态

不同形态的POD活性试验可得，不同花色花瓣中的POD活性，可溶态远大于结合态，二者差异极显著；且随着洗脱次数增加，可溶态POD活性急剧下降。说明鸳鸯茉莉花瓣中POD的绝大部分是以可溶态形式存在。因此，对鸳鸯茉莉花瓣中POD活性地检测只需要取第一次粗提液即可。

3.3 鸳鸯茉莉花瓣中POD与花色苷之间的关系

本试验结果显示，3种颜色的鸳鸯茉莉花花瓣中POD活性，由高到低依次为白花>淡紫花>紫花，不同花色间POD活性差异极显著（p<0.01）。随着发育时期延长，紫色褪去，花瓣中POD活性呈不断上升趋势。POD活性与花色的褪变呈正相关，即花色越淡，POD活性越强，并且其组分活性也发生了剧烈变化（见图7 a、e）。此试验结果初步表明，POD活性变化与鸳鸯茉莉花色变化密切相关。推测POD参与了鸳鸯茉莉花色素苷代谢的过程。这与前人报道的有关POD参与了大花鸳鸯茉莉花色素苷降解的结果一致，即POD活性增强，则花色苷降解，花色褪去[3， 7，15]。但对于POD如何与花色苷发生反应的机制没有做深入的研究。

鸳鸯茉莉开花后，花色在极短时间内（3～5 d）由深紫色变成白色，这为花色苷的体内代谢机制提供了一个独特的研究材料，此外，类似的如木芙蓉（Hibiscus mutabilis L.），其花色1日3变，即早晨白色，中午粉红色，傍晚深红色。有关醉芙蓉（木芙蓉的一个变种）花色变化机理研究报道，其花色变化主要是原花青素向花色素转化的过程，属于花青素的生物合成；而鸳鸯茉莉的花色变化主要因花色苷的降解引起[21]，二者的代谢途径不同。

有关鸳鸯茉莉花瓣中POD参与花色苷降解的机制机理目前研究较少。为此，对不同发育期鸳鸯茉莉花瓣内POD提取液的体系优化、及其不同形态POD活性的测定极其重要，不仅为以后鸳鸯茉莉POD纯化提供参考，也为后续研究鸳鸯茉莉花色变化的机理提供一个切入点。

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责任编辑：古小玲