HPLC法测定跳骨片中士的宁和马钱子碱的含量

林武俊 陈小玉 刘可福

【关键词】士的宁和马钱子碱；跳骨片；高效液相色谱法；含量测定

【文章编号】1004-7484（2014）04-2418-01

跳骨片由马钱子（制）、骨碎补、仙桃草等二十味中药组成的中药制剂，具有消肿定痛，活血舒筋，促进骨痂生长等作用，临床用于治疗各种骨折、脱臼、新久伤痛等具有良好疗效。原有质量标准中含量测定这一项用薄层扫描法，该方法精密度较差，为更精确控制本品的质量，对成品中的士的宁和马钱子碱的含量测定进行了改进和提高。参考有关文献（1）（2）（3），用高效液相色谱法测定其主药马钱子（制）中的士的宁和马钱子碱的含量，收到满意的结果，可用于跳骨片的质量控制。现报道如下。

1 实验仪器与试药

1.1仪器 日本岛津LC—10AVP高效液相色谱仪；赛多利斯BP-221S电子天平；KQ-250DE型医用数控超声波清洗器。

1.2试药 士的宁（批号110705-200306，供含量测定用）、马钱子碱（批号110706-200505，供含量测定用）购于中国药品生物制品检定所；跳骨片由福州屏山制药有限公司提供；乙腈为色谱纯；其它试剂为分析纯；水为超纯水。

2 实验方法

2.1色谱条件 色谱柱：Shimpack Vp-ods （4.6mmⅹ15cm）C18柱；柱温：室温；流动相为： 乙腈-0.01mol/L 庚烷磺酸钠与0.02mol/L磷酸二氢钾等量混合溶液（用10%磷酸调节pH值为2.8）（21：79）；流速：1.0ml/min；检测波长为260nm。理论塔板数应不低于2000。分离度大于1.5。

2.2对照品溶液的制备 分别精密称取士的宁12.48mg和马钱子碱11.15mg，置于同一100ml量瓶中，加三氯甲烷适量使溶解并稀释至刻度，摇匀，制成0.1248mg/ml士的宁和0.1115mg/ml马钱子碱作为储备液。再精密吸取上述储备液5ml，置于25ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，配成0.02496mg/ml士的宁和0.0223mg/ml马钱子碱对照品溶液，即得。

2.3供试品溶液的制备 取跳骨片20片，除去糖衣，研细，取1.5g，精密称定，置圆底烧瓶中，加氢氧化钠试液2ml，湿润，精密加入三氯甲烷25ml，密塞，精密称重，置水浴中加热回流2小时，取出放冷，称定重量，用三氯甲烷补足减失重量，摇匀，用铺有少量无水硫酸钠的滤纸滤过，弃去初滤液，精密吸取续滤液10ml，水浴蒸干，残渣加加甲醇溶解置10ml容量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜（0.45um）滤过，即得。

2.4阴性样品考察 取缺味马钱子阴性样品，按供试品溶液制备方法制备，按上述色谱条件测定，记录色谱图，结果其它成分对士的宁和马钱子碱的测定无干扰。

2.5 线性关系的考察线性关系的考察 精密吸取上述0.1248mg/ml士的宁和0.1115mg/ml马钱子碱储备液0.5、1、2.5、5、10、15、20μl，按上述色谱条件分别测定，记录峰面积。以士的宁和马钱子碱的进样量（ug）为横坐标，以相应的峰面积为纵坐标，进行线性回归。结果士的宁的回归方程为：Y﹦8.8529e-007X+5.7695e-005，r﹦0.9999， 马钱子碱的回归方程为：Y=1.144e-006X+1.1779e-003，r=0.9999，表明士的宁和马钱子碱进样量分别在0.0624～2.496ug，0.05575～2.23ug范围内，与其峰面积呈良好的线性关系。

2.6 精密度试验 精密吸取上述同一份对照品溶液，连续进样6次，每次10μl，测得士的宁峰面积平均值为280632，RSD﹦0.39%（n﹦6），测得马钱子碱峰面积平均值为190689，RSD﹦0.34%（n﹦6），表明仪器精密度良好。

2.7 稳定性试验 取跳骨片（批号130601），按供试品溶液的制备方法制得供试液，分别精密吸取同一供试品溶液，分别于制备后0、2、6、12、24、36h进样，每次20μl，测得士的宁峰面积平均值为275961，RSD﹦1.34%（n﹦6）， 测得马钱子碱峰面积平均值为109019，RSD﹦1.91%（n﹦6），结果表明样品36h内基本稳定。

2.8 重复性试验 精密称取士的宁对照品14.14mg、14.28mg，马钱子碱对照品12.91mg、13.10mg 分别置25ml量瓶中，加三氯甲烷溶解并稀释至刻度，作为对照品贮备液。分别精密量取上述对照品贮備液各1ml，置同一50ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，制成每1ml含士的宁11.31?g、11.42?g、马钱子碱10.33?g、10.48?g。取同一批供试品（批号130602）6份，按上述色谱条件测定，进样量为20?l，分别进样测定，测得士的宁平均含量0.259mg/g，RSD﹦0.21%（n﹦6）；马钱子碱平均含量0.178mg/g，RSD﹦0.69%（n﹦6）。表明该方法实验重复性良好。

2.9 加样回收率试验 分别精密称取士的宁18.08mg、马钱子碱12.71mg和分别置100ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，配制成含士的宁0.1808mg/ml、马钱子碱0.1271mg/ml的对照品贮备液。分别精密量取上述两种贮备液1ml各6份，至锥形瓶中，挥干溶剂，称取已知含量的样品（批号130602）0.75g，精密称重，按上述方法测定，对照品溶液取重复性项下作为对照溶液。计算回收率，结果见表1，表2。结果表明本法回收率良好，测量准确度较高。

2.10 含量测定 取跳骨片，去糖衣，研细，取1.5g，，按供试品制备项下制备供试液，在上述色谱条件下，分别进样20ul测定， ，按外标法计算样品含量，共测得10批样品，结果见表3，表4。

3 讨论

根据游离生物碱易溶于三氯甲烷的性质，采用碱性条件下使生物碱游离，再用三氯甲烷提取的方法制备供试液，根据空白干扰试验和回收率试验，证实此法既能排除干扰，杂质少，又可提取完全的目的。采用不同的提取方法制备样品溶液，以回流提取法提取效率最高。参考中国药典2010年版，采用庚烷璜酸钠作为离子对试剂，与士的宁和马钱子碱形成离子对，增加其在色谱柱固定相的保留，使采用反相HPLC法成为可能，在流动相中加入少量磷酸二氢钾，并调节适宜的pH值，可提高柱效，减少色谱峰拖尾，峰型较好，提高了分离度。供试品色谱中士的宁与马钱子碱得到较好的分离，其色谱峰保留时间与对照品一致。理论板数以士的宁峰计算大于2000。

跳骨片中的制马钱子为主要的药味，制马钱子的主要有效成分是生物碱，士的宁和马钱子碱各占其生物碱总量的约40%，安全使用范围较小，对跳骨片中士的宁和马钱子碱含量均应进行控制，对马钱子中士的宁含量测定方法主要有分光光度法，比色法，薄层扫描法，高效液相色谱法等，其中以高效液相色谱法测定较为灵敏，准确，故本研究采用高效液相色谱法进行含量测定，具有简便、快速、准确等优点，且精密度和重现性较好，适合于跳骨片质量控制。

参考文献

[1] 吴皓、蔡宝昌、郑培新等.炮制对马钱子中生物碱的影响[J].中国中药杂志，1994，19（5）：277-279

[2] 潘金火、严国俊、周娟娟.马钱子粉中士的宁和马钱子碱含量测定方法的研究[J].中国药学杂志，2010，（13）：1024-1029

[3] 宋金春、杨芝、张立.复方马钱子片中士的宁和马钱子碱含量的测定[J].医药导报，2002，21（2）：120-122