内异症患者增生期内膜组织基质金属蛋白酶-2、血管生长因子、凋亡细胞调节基因水平表达的相关性研究

李红

【摘 要】目的：研究基质金属蛋白酶-2（MMP-2）、血管生长因子（VEGF）、凋亡细胞调节基因（Bcl-2和Bax）在增生期子宫内膜异位症(内异症,EMs)患者中的水平表达的相关性。方法：采用免疫组化法检测内异症56例异位内膜、40例在位内膜和48例对照组的增生期子宫内膜中MMP-2、VEGF、Bcl-2和Bax的表达。结果： ①MMP-2表达异位内膜组高于在位内膜组和正常内膜组，差异有统计学意义(p＜0.05)；②VEGF表达异位内膜组强于在位组和对照组内膜，差异有统计学意义(p＜0.05)； ③Bcl-2和Bax蛋白表达各组间差异无统计学意义(p＞0.05)，但Bcl-2表达在异位内膜增生期最强；④MMP-2、VEGF、Bcl-2和Bax各指标之间均存在等级相关性。结论：MMP-2、VEGF、Bcl-2和Bax可能相互影响，共同参与子宫内膜异位症的发生发展。

【关键词】子宫内膜异位症；MMP-2；VEGF；Bcl-2；Bax；免疫组织化学

【中图分类号】R711 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484（2014）03-01107-01

子宫内膜异位症(内异症，Endometriosis，EMs )指子宫内膜在子宫腔被覆面以外的地方种植生长，包括内膜间质和上皮细胞在子宫腔以外部位的异位生长，是生育期妇女的常见病。近年来EMs的发病率有上升趋势，其在分子水平上的发病机理尚不完全清楚。基膜的完整与否也是影响EMs发生侵袭与转移种植的关键环节。MMPs是一组与锌结合的主要分解细胞外基质的蛋白酶，与EMs的侵袭和转移的关键环节[2]。本研究采用免疫组化法对EMs内膜中的MMP-2、VEGF 、Bcl-2和Bax水平进行检测，探讨其在EMs相关性及发生发展中的作用，为EMs的临床诊断和治疗提供科学依据和新思路。

1 材料与方法

1.1 标本

所选病例为2011年6月~2012年12月期间就诊于莱西市市立医院妇产科的子宫内膜异位症患者56例（术后病理检查证实为内异症者），年龄28~50(34.3士5.2)岁，同时通过刮宫或切开手术取其在位子宫内膜40例，年龄28~51(35.2士4.3)岁。选择同期因子宫肌瘤行子宫切除术的48例正常子宫内膜为对照组，年龄26~48(35.8士3.9)岁，所有内膜均为增生期。所有患者无其它内外科及内分泌疾病，术前三个月未应用激素治疗，月经周期规律。所有组织术后立即取材，经10%甲醛固定，石蜡包埋，5μm连续切片5张，1张行常规HE染色进行病理形态学观察，余者用于免疫组织化学染色。

1.2 方法

1.2.1主要试剂：兔抗人VEGF多克隆抗体试剂盒购自武汉博士德生物技术有限公司，鼠抗人MMP-2、Bcl-2、Bax单克隆抗体、SP免疫试剂盒和山羊血清、DAB显色试剂盒均购自福州迈新生物技术开发公司。

1.2.2 SP法检测：MMP-2、VEGF、Bcl-2、Bax蛋白表达 切片常规二甲苯脱蜡，梯度酒精至水。采用SP法进行免疫组织化学染色，实验操作严格按说明书进行。以0.01M PBS代替一抗作为阴性对照，以已知阳性标本为阳性对照。

1.2.3 免疫组化阳性判断标准：MMP-2、VEGF、Bcl-2和Bax阳性信号为腺上皮细胞胞浆呈棕黄色着色，根据文献Krajewska[1]，按半定量的方法评定每一张标本:随机选取高倍镜（×400）下至少5个视野，计数阳性细胞的百分率，并进行计分（0~4分），同时对阳性细胞免疫染色强度进行计分（0~ 3分），免疫组化染色评分=阳性细胞百分数评分×染色强度评分。0分为阴性(-)，1~2分为弱阳性(+)，3~4分为中等阳性(++)，4分以上为强阳性(+++)。

1.3 统计学处理

应用SSPS11.0软件进行统计学处理，秩和检验比较各组间免疫组化结果，Kendalls W等級相关分析相关性。

2 结果

2.1 基质金属蛋白酶-2(MMP-2)表达情况

MMP-2主要表达于子宫内膜组织的腺上皮细胞胞浆中，间质中也有表达。异位内膜组与在位内膜组和对照组之间差异有统计学意义，在位内膜组和对照组之间差异无统计学意义，见表1。

2.2 血管生长因子(VEGF)表达情况

VEGF主要定位于腺上皮及血管内皮细胞的胞浆中，同时也分散存在于周围间质细胞中。异位内膜表达强于在位和对照组内膜，差异有统计学意义，见表1。

2.3 凋亡调节基因（Bcl-2、Bax）表达情况

Bax主要表达在腺上皮细胞胞浆，异位内膜组表达低于在位内膜组和对照组，但差异无统计学意义，见表1。Bcl -2蛋白主要表达于子宫内膜腺上皮细胞浆和/或细胞膜上，偶见细胞核表达，呈黄色或棕黄色。异位内膜表达强于在位内膜和对照组，差异无统计学意义，见表1。

2.4各指标间相关关系

采用Kendalls W等级相关，分析异位内膜组MMP-2、VEGF、Bcl-2和Bax之间的相关性，发现各指标间存在等级相关性，见表2。

3 讨论

近年，随着月经初潮的低龄化，分娩的高龄化及少育的现象，EMs成为年轻女性及育龄女性多发疾患之一，其发病率也呈上升趋势。目前一致认为侵袭、转移、种植是EMs的主要特征，由多步骤、多因素参与的复杂过程。凋亡细胞调节基因Bcl-2与Bax参与了这复杂过程，而对细胞外基质的降解及血管生成是重要先决条件[3]，因此，对EMs的相关性研究更具有临床意义。

3.1 MMP-2在异位症中的作用

本实验发现，MMP-2在异位内膜组呈高水平表达，而在位内膜组和对照组呈低水平表达，与文献报道一致[4-6]，提示异位病灶具备较高的蛋白水解能力，由于MMP-2的蛋白水解活性有利于腹腔的侵袭，因此异位内膜中MMP-2蛋白的过度表达可使其具有较高的侵袭能力，能够降解异位内膜周围的基底膜及其它ECM成分，破坏腹膜间质细胞的连接，进而侵袭腹膜及病灶周围的结缔组织，使异位内膜在腹膜内种植生长并使病灶不断扩大，异位内膜一旦植入腹膜表面后，腹腔微环境发生变化，各种细胞因子分泌增加，MMP-2的表达进一步增加，侵袭力进一步增强，促进了EMs形成和病情的进展。

3.2 VEGF在在异位症中的作用

VEGF是参与调控血管生成的最重要的血管生长因子，对于血管内皮细胞有高特异性的促增殖作用，可直接而特异地作用于血管内皮细胞，导致新生血管形成。异位内膜中VEGF含量增高，在内分泌和旁分泌的共同作用下刺激毛细血管增生，为异位生长的腺上皮细胞提供赖以生存的物质基础，促进异位内膜增殖和侵袭入腹腔内组织。本研究结果表明，VEGF在异位内膜组、在位内膜组和对照组中表达强度依次减弱，提示子宫内膜异位症中血管生成活动增强。

3.3 Bcl-2和Bax在异位症中的作用

凋亡作为一种生理或病理性的细胞消亡，普遍存在于生物界，机体通过凋亡消除衰老的细胞并代之以新的细胞，从而维持组织器官中细胞数量的稳定。子宫内膜的周期性增生与脱落通过细胞增殖和凋亡形式来实现 [7] 。凋亡存在于子宫内膜异位症患者在位、异位内膜及腹腔液巨噬细胞中，凋亡调节基因Bcl-2和Bax在EMs的发生发展中起重要作用。Bcl-2是一种原癌基因，其重要生物学功能是延长细胞寿命并增加细胞对多种凋亡刺激因素的抗性，被称为凋亡抑制基因，Bax加速细胞死亡，被称为细胞凋亡促进基因，这两类蛋白质的比值决定细胞在受到凋亡信号刺激时是否发生凋亡。Bcl-2/Bax异二聚体的比值在凋亡中起重要作用，其比值越低，凋亡越明显。

本研究结果显示，虽然Bcl-2和Bax蛋白在正常子宫内膜、在位和异位子宫内膜表达差异无统计学意义，但Bcl-2表达在异位内膜增生期最强，而Bax蛋白表达在异位内膜最弱，Bcl-2和Bax共同表达于正常子宫内膜、在位和异位子宫内膜增生期腺上皮，且Bcl-2明显占优势，说明增生期Bcl-2/Bax比值上升，抑制细胞凋亡，保证此期内膜细胞进行大量的增生，对子宫内膜功能层进行快速的修复，促进内异症的发生和发展。

3.4 MMP-2、VEGF、Bcl-2和Bax之间的相互作用

分析异位内膜组MMP-2、VEGF、Bcl-2和Bax的相关性，发现各指标间存在较强的相关性，提示细胞外基质降解、血管生成及细胞凋亡可能以某种机制共同参与子宫内膜异位症异位病灶的形成和发展，进一步证实了子宫内膜异位症是一个多因素疾病，其作用机制目前尚不清楚，有待于进一步研究。

参考文献

[1] 任云青.子宫内膜异位症与细胞凋亡[J].医学综述，2005，11（8）：689-691.

[2] 王红，吴若松.基质金属蛋白酶-2、9在子宫内膜异位症中的表达[J].现代妇产科进展，2002，11(4)：261~262.

[3] 黄博，陈茂怀。细胞外基质金属蛋白酶诱导因子与肿瘤转移关系的研究进展[J]。汕头大学医学院学报，2006,19（4）：293-296

[4] 邱晓红，李荷莲.基质金属蛋白酶MMP-2、MMP-9及抑制因子TIMP-1 TIMP-2在子宫内膜异位症中的表达及意义[J].中国实用妇科与产科杂志，2004，20（3）：158~160.

[5] 李铁臣，孔丽娜，孙青，等. 子宫内膜异位症中MMP-2，MMP-9表达的研究[J].皖南医学院学报，2005，24（2）：107~108.

[6] Mizumoto,Saito T,Ashihara K et al.Expression of matrix metalloproteinases in ovarian endometrio：immunohistochemical study and enzyme immunoassay,Lite Sci,2002,71(3):259~273.

[7] 王百霞，李亞里.细胞凋亡与子宫内膜异位症[J].解放军医学杂志，2000，25(6):161-163.