梨孢镰刀菌的PCR体系检测与优化

陈佩佩　程贺　赵长新

摘要：本文建立了梨孢镰刀菌的PCR检测方法，并对PCR体系中反应条件进行了优化：引物检测梨孢镰刀菌的最适退火温度为52℃；Taq DNA酶的最适用量为0.4μl；最适Mg2+离子浓度为2.0mM；最适循环数为30次循环；；微管蛋白基因引物具有良好的特异性；梨孢梨孢镰刀菌DNA的最低检测限为417pg，表现出良好的灵敏性。

关键词：梨孢镰刀菌 PCR 条件优化

中图分类号：Q36 文献标识码：A 文章编号：1672-5336（2014）06-0028-02

1 引言

本文建立了梨孢镰刀菌的PCR检测方法，在制麦早期内检出大麦内部的梨孢镰刀菌，及早地防止毒素对原料的污染以及有效地控制啤酒喷涌，对大麦品质的判断提供了简单易行，快速的手段，从而为提高麦芽品质奠定了基础。

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 菌种

梨孢镰刀菌Fusarium poae（AY188915.1）来自本实验室从澳大利亚大麦（Hordeum sp.Schooner）中分离鉴定的菌株；禾谷镰刀菌是本实验保存；大肠杆菌（CGMCC-1.1369）、乳酸克鲁维酵母（CGMCC-2.1494）购自中国微生物菌种保藏中心；乳酸杆菌来自北京三元食品有限公司技术中心实验室。

2.1.2 主要试剂

溶菌酶、RNaseA、EDTA、SDS、NaCl、无水乙醇、等均为国产分析纯；琼脂糖（Spain Agarose香港基因公司分装）；Taq DNA 聚合酶、dNTPs、100bp DNA Marker购自北京全式金生物技术有限公司，PDA培养基，PBS溶液。

2.1.3 仪器

ZPS-250 h智能恒温恒湿培养箱，Unic-7200紫外分光光度计，低速离心机LD4-2A（2800×g），高速冷冻离心机B22 m，2100P型自动糖化器，精密电子称，电热鼓风干燥箱，HH-6数显恒温水浴锅，GeneAmp PCR System 2400 PCR，PAC300电泳仪，Tanon GIS 2010凝胶成像仪，离心机2K15（Sigma），Thermo pH计，LRH-250生化培养箱，Cintra 20分光光度计。

2.2 实验方法

2.2.1 模板DNA的提取

在无菌条件下，用灭菌处理的接种环挑取梨孢镰刀菌菌落，接种于5ml PDA培养基中，28℃培养3天后使用无菌滤纸进行过滤获得菌丝体。称取约0.1g菌丝体提取基因组DNA，提取方法参考文献。

2.2.2 扩增引物的设计

依据引物设计原则，利用生物软件ClustalW比对及Primer 5.0设计引物，引物由北京博迈德科技发展有限公司合成。引物的基因位点为46-337，PCR扩增产物长度分别为292bp。

2.2.3 PCR反应

梨孢镰刀菌基因组DNA的PCR扩增，反应体系为：模板1μl，上游引物0.5μl（25μmol/l），下游引物0.5μl（25μmol/l），10×扩增反应缓冲液2μl，PCR染料2μl，dNTPs 0.5μl，Taq DNA聚合酶0.5μl，无菌超纯水13μl，总体积为20μl。

离心混匀后置PCR仪上进行自动化扩增反应，循环参数为94℃预变性5min，94℃变性45s，52℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环，最后72℃延伸10min。

2.2.4 PCR反应条件的优化

（1）退火温度的优化。设置退火温度的梯度为49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃，在这几个退火温度中优化出最适退火温度。（2） Taq DNA酶浓度的优化。Taq DNA酶的浓度梯度为1.0U、1.5U、2.0U、2.5U，相对应的体积为0.2μl、0.3μl、0.4μl、0.5μl，在这几个酶浓度中优化出最适酶浓度。（3）Mg2+离子浓度的优化。Mg2+离子浓度的梯度为：1.0mM、1.5mM、2.0mM、2.5mM，已知Mg2+离子浓度为25mM，所需要的体积分别为：0.8μl、1.2μl、1.6μl、2.0μl，在这几个浓度中优化出最适Mg2+离子浓度。（4）循环数优化。设置循环数为28、30、32，从中优化出最适循环数。

3 结果与讨论

3.1 梨孢镰刀菌的存在位置以及生长活动

观察图1（a）中的大麦表面的光学显微镜图，可以发现镰孢菌菌丝可以透过大麦种皮生长；图1（b）是麦芽染菌图片，A所指是镰刀菌存在于大麦腹沟位置，B所指为菌丝由麦芽根部伸出，C所指为镰刀菌包围种子。

3.2 PCR反应结果

3.2.1 PCR反应条件优化结果

（1）最适退火温度的选择。退火温度为49℃～54℃时都有特异性的目的带扩出，且无非特异性条带。比较可知退火温度为52℃时292bp目的帶较宽较清晰，故选52℃为该引物检测梨孢镰刀菌的最适退火温度。（2）最适Taq DNA酶浓度的选择。体积为0.4μl即浓度为2.0U时，目的带较亮较清晰，故0.4μl为Taq DNA酶的最适用量。（3）Mg2+离子浓度的选择。最适Mg2+离子浓度为2.0mM。（4）循环数的选择。循环数为30时，PCR扩增效果最佳，故选择30次循环为最适循环数。

3.2.2 引物的特异性分析

使用微管蛋白基因的引物同时对大肠杆菌、乳酸杆菌、乳酸克鲁维酵母、禾谷镰刀菌、梨孢镰刀菌以及阴性对照进行PCR检测，阴性对照和对照组均无条带扩出，可知，该引物具有良好的特异性。

3.2.3 DNA的最低检出限的确定

使用紫外分光光度计测定260nm波长下的OD值为0.8336，DNA含量=417μg/ml，将其逐步进行10倍系列稀释，将这些DNA稀释液作为模板进行PCR反应，梨孢镰刀菌DNA的最低检测限为417pg。

4 结语

本研究结果表明，使用PCR手段检测梨孢镰刀菌的方法是可行的，且检测的周期短，具有很高的灵敏度，避免在后续的啤酒发酵工序中由梨孢镰刀菌产生的毒素造成原料的污染和浪费，在制备麦芽时起到了预防的作用。

参考文献

[1]俞大钹.镰刀菌分类学的意义.微生物学报，1977，17（2）：163-171.