乳酸菌胞外多糖的分离筛选方法研究进展

李佳琪等

摘要：本文综合叙述了筛选高产胞外多糖乳酸菌的常用方法和分离纯化胞外多糖的多种途径。采用哪些方法取决于原材料、菌株特性及培养基类型，同时这些方法也决定着分离胞外多糖的精确度及纯度。因此，本文旨在通过对比这些方法的优缺点，为提取高纯度的乳酸菌胞外多糖提供参考，并为进一步进行胞外多糖的结构鉴定奠定基础。

关键词：乳酸菌 胞外多糖 分离筛选 方法

中图分类号：TS201.3 文献标识码：A 文章编号：1672-5336（2014）06-0001-03

1 引言

乳酸菌，是一类无芽孢、革兰氏染色为阳性的异养厌氧型原核细菌，能够发酵糖类，产物主要为乳酸（辨别的主要标志），其形态多样主要以链状和杆状存在。乳酸菌對人体有诸多益处，比如乳酸菌在生长过程中消耗乳酸对预防和治疗乳糖不耐症有良好的作用；同时发酵的产物可以促进钙、镁离子及蛋白质、单糖等营养物质的吸收；还可以产生B族维生素等大量有益物质；另外，乳酸菌的生长可以增加肠道的益生菌群，进一步改善人体胃肠道功能，保持人体肠道内菌群平衡，维护人体健康；也可以抑制腐败菌的繁殖；同时消解腐败菌产生的毒素，清除肠道垃圾；代谢产物还可以抑制胆固醇吸收，有降血脂、降血压作用；亦可以提高SOD酶活力，消除人体自由基，具有抗衰老、延年益寿作用。此外，还有一些报道认为乳酸菌能有效的预防女性泌尿生殖系统细菌感染，还能控制人体内毒素水平，保护肝脏并有助于增强肝脏的解毒、排毒功能。总之，乳酸菌现在是备受瞩目，前景广阔。

胞外多糖（exopolysaccharide，EPS）是由细菌及少数酵母菌和丝状真菌在生长的过程中产生的。微生物产生的EPS可以在自然环境中起到保护微生物细胞的作用，比如使细胞避免因干燥而引起脱水、防止被噬菌体侵染，同时还可维持细胞的渗透压，并且参与到细胞的信息传递和细胞的构成等作用。自从通过肠膜明串珠菌肠膜亚种（Leuconostc mesenteroides subsp. mesenteroides）的发酵生产出右旋糖酐以来，乳酸菌胞外多糖的开发与应用便引起了诸多研究人员的关注，已变成了一个重大的研究热点[1]。

乳酸菌EPS是乳杆菌诸多菌属中多种乳酸细菌在特定环境下分泌到细胞壁外的黏液或荚膜多糖（capsular polysaccharide）。乳酸菌EPS的作用很多，在酸乳形成方面，对其质构与风味，产生特有的营养价值方面有极为重要的作用与影响，它可以增加酸奶的黏度，提高酸奶稳定性和保水性，使产品具有良好的口感、质地和风味。又因为乳酸菌EPS具有安全无毒的特性，所以在食品工业中作为增稠剂、稳定剂、乳化剂、胶凝剂及保湿剂而被广泛的应用。通过研究，部分乳酸菌EPS还具有抗肿瘤、抗病毒、抗衰老、降低血糖、增强人体免疫力、调节胃肠功能、降血清胆固醇等多种生理功能，因此将其开发为功能性食品具有广阔的推广前景。

本文综合阐述拉近几年有关乳酸菌EPS分离纯化实验的研究报道，总结分析一些分离纯化的手段并说明其优缺点，旨在找到高效的分离纯化方法，为化学结构与功能的鉴定试验提供纯度保证，为进一步研究EPS的分子结构、生理功能与分子作用机制奠定基础[2]。

2 产胞外多糖乳酸菌的筛选方法

2.1 MRS-溴甲酚紫平板筛选法

MRS-溴甲酚紫平板筛选法是指将MRS培养基中的葡萄糖用2%的蔗糖代替，加入0.05%的溴甲酚紫配成MRS-溴甲酚紫培养基，利用划线法进行菌种的分离培养。在MRS-溴甲酚紫平板上产黏并能使溴甲酚紫变黄的菌落，即为产胞外多糖的乳酸菌菌落。MRS-溴甲酚紫平板筛选法是一种简单、可行性高的初步筛选方法。

2.2 拉丝法和黏度测量

一般产胞外多糖的乳酸菌菌落表面光滑，具有拉丝现象，因此只需用无菌牙签接触菌落，轻轻地向外拉，在培养基表面形成连续的拉丝，即该菌落可以产胞外多糖。因此，菌落拉丝法是一种简便而有效的产胞外多糖的乳酸菌筛选方法，可用于广泛筛选。但是该方法有局限性，各别乳酸菌菌株是否产生黏性菌落取决于培养基及培养条件。对于产黏性菌落的菌株来说，产生黏性菌落亦有遗传不稳定性，传代培养数代后会出现产非黏性菌落的变异。但是，失去产黏性菌落的特性不会影响发酵乳制品的质量，因此可将乳酸菌接种于脱脂乳中培养，通过采用黏度仪测量酸奶的黏度来判断是否产生胞外多糖[3]。

2.3 染色法及显微镜镜检法

该法多用于荚膜多糖的检测。由于荚膜多糖紧密地包裹在菌体细胞壁外又不易着色，因此采用墨汁染色镜检时，菌体外出现透明光圈。分子量较小的EPS产量少时可能附着在细胞壁外出现此现象。近年来，激光共聚焦显微镜（CSLM）技术已用于观察产EPS菌株发酵的乳制品微观结构。该方法中可用伴刀豆蛋白A 488对EPS进行染色，然后用CSLM直接观察到乳制品中的EPS[4]。

2.4 液体培养基检测法

由于产胞外多糖乳酸菌的来源不只局限在乳制品中，各类乳酸菌发酵制品均可作为筛选高产EPS的原材料。因此，将分离后的乳酸菌在特定培养基中培养后进行EPS检测的方法最常见。其中，不同研究者采用了不同的培养基。Van GeelSchutten等人（1998）采用含有高浓度碳水化合物的MRS培养基来筛选产EPS乳酸菌，并尝试了不同碳源，结果表明含蔗糖培养基是检测产EPS现象的最好选择。但是，之后也有不同报道认为，各别含葡萄糖或半乳糖的培养基中EPS产量最高。这些差异可能是与合成EPS的酶系有关，对于eps基因簇的分子组成及EPS合成酶相关的研究进展可能有助于解释这些现象。

3 乳酸菌胞外多糖的分离纯化方法

3.1 胞外多糖的分离提取方法

通常，分离提取EPS的方法难易程度取决于培养乳酸菌菌株所使用的培养基成分。最简单的步骤是将培养液离心去除菌体后采用乙醇沉淀法收集沉淀，冷冻干燥后对水透析分离提取EPS。

乙醇沉淀法是指向得到的上清液中加入3～5倍体积的95%乙醇，4℃冷藏过夜，使多糖呈絮状沉淀析出，然后在温度为4℃下离心，收集沉淀即为乳酸菌的胞外多糖[6]。透析法是指将乙醇沉淀物用少量蒸馏水复溶后装入透析袋，在4℃的条件下，于蒸馏水中透析48h，每隔4～6小时换一次水，即可得到较纯的EPS水溶液[8]。该方法可根据透析袋的截留分子量有效去除一些小分子物质及盐类等杂质。也可先将乳酸菌发酵液装入透析袋中进行透析，然后再使用乙醇沉淀法得到胞外多糖[7]。也有研究者利用丙酮沉淀法，但目前乙醇沉淀仍是乳酸菌EPS分离纯化中非常常用的手段，因为乙醇不仅价格便宜，而且使得胞外多糖沉淀完全。

培养基成分中蛋白质含量较多时（如脱脂乳培养基、乳清培养基等），需要采用另外的纯化步骤降低EPS沉淀中的蛋白质含量。目前常用的除蛋白的方法主要有三种：

3.1.1 Sevage法除蛋白

Sevage法首先是将氯仿和正丁醇按一定（4：1或5：1）比例配制成Sevage液待用，然后将粗品EPS复溶后，加入1/3体积的sevage液，振荡、离心、去除沉淀，重复三次，即可除去粗品EPS中的蛋白。此法可避免EPS降解，减少EPS损失，但脱除蛋白质的效率不高。但如果与酶解法相结合，除蛋白效果将会有所提高。

3.1.2 酶解法

用饱和NaOH溶液将粗品EPS溶液pH调至8.0后离心，取上清液再用HCL调节pH至4.6后离心，接下来调节pH至7.5，加入现配的浓度为3g/L的胰酶液，然后水浴、离心。此法的缺点在于会有酶蛋白残留。不过，再结合使用sevage法，可以改善除蛋白的效果[4]。另外，也有使用链霉蛋白酶E的报道。

3.1.3 三氯乙酸法

三氯乙酸法是指取37℃下培养24h的乳酸菌EPS 发酵液，向其中滴加三氯乙酸（终浓度至4～14%），充分振荡后离心去沉淀，或先将乳酸菌EPS发酵液经离心后取上清液，在上清液中加入三氯乙酸，4℃静置过夜，最后离心以脱除蛋白质[5]。这种方法除去蛋白质的效果较好，在实验中使用广泛，但缺点是会使某些EPS发生降解，造成损失。刘慧等人在实验中发现，若在实验中提高三氯乙酸的pH值或低温下处理乳酸菌EPS发酵液，都可以减少EPS的降解。如果酶解法和三氯乙酸法相结合，不仅可以彻底除去蛋白质，减少EPS的降解，而且可以除去酶解后残留的酶蛋白，是目前相对较好的除蛋白的方法。

此外，还有三氟三氯乙烷法。它是指向乳酸菌EPS发酵液中以1：1的体积加入三氟三氯乙烷，在低温下搅拌10min左右，离心后取上层水液，重复上述处理方法数次，即可得到除去蛋白的EPS溶液。这种方法效率较高，但是残留的溶剂存在危险，现在基本不使用。

3.2 乳酸菌胞外多糖的纯化方法

除了沉淀EPS和去除蛋白质外，还需要其他步骤进一步纯化提取到的粗品EPS，用于进行特性分析、结构鉴定等要求高纯度的试验研究。这些方法包括，超滤法、薄层层析层析法和柱层析法。

3.2.1 超滤法

超滤法是一种膜分离技术，利用不同截留分子量的超滤膜分离装置进行多糖的进一步分级纯化，在应用于对多糖的发酵液进行预处理时，不仅可以浓缩澄清的多糖，还可分离发酵液中残余的培养基组分，如糖、含氮物质、无机盐等。该方法对仪器设备要求高，但是有操作方便、能耗低、效率高、条件温和、破坏小等许多优点，并且得到的纯度和回收率均高于传统方法提取的多糖，对于分子量相对较大、溶液黏度大且不稳定的多糖来说是一种极具发展潜力的分离手段，目前相关报道较少，但将来必将得到广泛应用[9]。

3.2.2 柱层析法

柱层析法是纯化活性的EPS常用方法，具体的有纤维素阴离子交换柱层析、凝胶柱层析等。柱层析法是考虑乳酸菌EPS自身一些特点的一种方便、快捷的纯化方法。但是运用柱层析方法是需要注意：①纯化柱的选择：纯化柱的长度对分辨率有较大影响，且其长短与分辨率成正比，但是长度不宜太长，否则会引起柱子的不均一。②填料的选择：填料选择时要考虑纯化EPS的分子量、黏稠度及填料本身的颗粒大小等条件。一般根据多糖样品的情况确定一个合适的分离范围，再根据分离范围选择合适的凝胶。③填料的溶胀：保证样品的均一性。④装柱：装柱时注意干湿法的选择。干法装柱速度快，溶剂消耗少，但分辨率较低、柱效差，比较适合大量样品的初步分离纯化；而湿法装柱的柱效较高，适合纯化研究用的少量样品。⑤洗脱速度与流速：一般洗脱速度恒定、流速适当，可使样品与凝胶填料基质充分平衡，分离效果好。洗脱速度慢会造成样品扩散加剧、区带变宽，从而降低分辨率、大大延长实验时间。

4 乳酸菌胞外多糖的测定方法

经过分离纯化后，采用冷冻干燥可得到EPS干粉，其重量可作为检测EPS产量的最简单的方法。但该方法的准确度取决于纯化程度，有可能包括了部分蛋白质或非EPS碳水化合物成分。因此，传统的显色方法（如苯酚硫酸法、蒽酮硫酸法等）以及现在仪器检测法（如高效液相色谱法）较常用。

4.1 苯酚硫酸法

苯酚硫酸法是目前最常用也是技术非常成熟的多糖测定方法。该方法的关键之处在于需要预先用已知浓度的葡萄糖溶液绘制出以葡萄糖密度为横坐标，吸光度为纵坐标的葡萄糖标准曲线。再用硫酸—苯酚法测得 EPS水溶液的吸光度，在标准曲线上查找对应的糖含量，即得乳酸菌胞外多糖产量。这种方法操作简单、灵敏性高、反应快速、重复性好，广泛应用于不同方法提取到的EPS产量测定，是EPS含量测定是常用的一种方法[10]。

4.2 色谱法

目前，在色谱法中高效液相色谱法（HPLC法）是最常用的一种方法。利用HPLC法不僅可以克服苯酚—硫酸法的繁琐操作，而且也可以避免因其他方法造成的杂质残留而引起的结果偏高。但是HPLC法对设备要求高，还要求有专一的糖和氨基柱。

利用HPLC法测乳酸菌胞外多糖时，首先需要配制标准储备溶液：用纯净水将2g干燥且恒重的木糖、葡萄糖、果糖分别定容与50ml容量瓶中；其次需要配制标准使用液：用移液管分别吸取1ml、2ml、3ml、5ml上述标准储备液，用重蒸馏水定容与10ml容量瓶中，经0.22μm微孔过滤后备用；然后将20.00mg胞外多糖样品溶于20ml的2.0mol/L硫酸中，沸水浴水解8h，用BaCO3中和至中性，经0.22μm微孔过滤后备用；最后装样、测定。若为纯品在色谱柱中洗脱后得到单一对称峰，电泳后得到单一斑点[11]。

除了高效液相色谱法外，气相色谱法也是经常使用的手段之一。虽然气相色谱法广泛应用于生物材料中单糖组分和生物高聚物结构的研究，但是微生物产生的胞外多糖的单糖组分差异很大，糖类是一种挥发性较差的化合物，在用气相色谱法分析各种单糖时，必须先将糖类转变为挥发性衍生物。所以，尽管色谱法现在正在被广泛认可与赞许，但是因其设备费用昂贵又要求设备的高精准度，其在胞外多糖的测定上仍然有待进一步更完善的发展。

根据不同实验材料不同实验目的，研究者们采用不同胞外多糖纯化和检测策略，本文将近几年内代表性文章中使用的方法进行了汇总（见表1）。

5 展望

近些年随着人们愈加关注天然、健康的产品，乳酸菌EPS也同样进入了大众的视线内，并且其分离纯化也已经备受关注，特别是以乳酸菌EPS结构鉴定为基础，进而分离纯化，具体方法可依据乳酸菌EPS的性质及其共存的组成成分来决定。虽然分离乳酸菌EPS的各种方法各有不同，条件亦比较成熟，但是高产菌株较难选取，所以乳酸菌EPS的提取率并不高，而且乳酸菌EPS分离纯化方法的滞后，影响和制约了乳酸菌EPS的研究与产品的工业化。因此，未来必须改进EPS分离纯化方法，优化工艺以提高提取率与纯度，为EPS分子结构、生理功能与分子作用机制的进一步研究及其产品的工业化奠定基础。

参考文献

[1]Roel Van der Meulen，Silvia Grosu-Tudor，Fernanda Mozzi，Frederik Vaningelgema，Medana Zamfir，Graciela Font de Valdez，Luc De Vuyst.Screening of lactic acid bacteria isolates from dairy and cereal products for exopolysaccharide production and genes involved.

[2]P.Ruas-Madiedo and C.G.de los Reyes-Gavilaa'n.Invited Review：Methods for the Screening， Isolation， and Characterization of Exopolysaccharides Produced by Lactic Acid Bacteria.

[3]田丰伟，丁虎生，丁纳，赵建新，等.产胞外多糖的乳酸菌的简便筛选与鉴定. 食品与发酵工业，2008，34，（03）：15-19.

[4]王静颖.乳酸菌胞外多糖的提取与纯化.聊城大学学报（自然科学版） 2006，19，（04）.

[5]唐血梅，李海英，赵芳，姚新奎，等.新疆酸马奶中高产胞外多糖乳酸菌筛选鉴定及培养条件优化研究.新疆农业科学2012，49（8）：1540-1545.

[6]孙军德，刘先.高产胞外多糖乳酸菌的筛选及培养条件优化.沈阳农业大学学报，2010-02，41（1）：90-93.

[7]刘先，康小红，孙军德.高产胞外多糖乳酸菌的筛选与初步鉴定.农产品加工·学刊，2010，3：37-40.

[8]刘丽波，李春，孟祥晨，霍贵成.乳酸杆菌胞外多糖高纯的提取工艺的优化.食品工业科技2009，30，（03）.

[9]梅秀明，潘道东.乳酸菌发酵液中胞外多糖的超滤浓缩技术研究.食品科学，2008，29，（12）413-416.

[10]王瑞琼，张红星，熊利霞，易欣欣，刘慧.乳酸菌胞外多糖分离纯化方法研究进展.食品科学，2009，29，（08）700-703.

[11]郭興华，凌代文，等.乳酸菌细菌现代研究实验技术.