升血颗粒质量标准研究

戴晓雁，王玉洁，魏学兵

1 甘肃省肿瘤医院，甘肃 兰州 730050；2 甘肃省药品检验所

升血颗粒质量标准研究

戴晓雁1，王玉洁1，魏学兵2

1 甘肃省肿瘤医院，甘肃 兰州 730050；2 甘肃省药品检验所

目的：建立升血颗粒的质量标准。方法：采用薄层色谱（TLC）法对升血颗粒中山茱萸、黄芪、丹参、麦门冬进行定性鉴别；采用高效液相色谱法对升血颗粒中马钱苷的含量进行定量测定。结果：TLC斑点清晰、分离度好，阴性对照无干扰；马钱苷进样量在0.0752～0.451μg/mL范围内与峰面积呈良好线性关系（r＝0.9983），平均加样回收率为96.2％，RSD＝2.3％（n＝6）。结论：所建立的标准可用于升血颗粒的质量控制。

升血颗粒；质量标准；薄层色谱法；高效液相色谱法

升血颗粒是甘肃省肿瘤医院院内制剂（甘药制字Z04410885），由山茱萸、黄芪、丹参、麦门冬等20余味中药组成，具有健脾益肾，益气生血，升高白细胞、血小板及补血作用，可明显减轻放、化疗的毒副反应，减缓放、化疗血象下降，增强机体免疫力［1-6］。本研究对处方中山茱萸、黄芪、丹参、麦门冬进行薄层色谱（TLC）鉴别，并对方中主药山茱萸有效成分马钱苷的含量采用高效液相色谱（HPLC）法进行测定，建立制剂的质量标准，以期有效控制制剂质量，从而达到确保临床疗效的目的。

1 材料

1.1 仪器与试药 Waters 515液相色谱仪（美国Waters公司）；AE260型万分之一电子天平（瑞士Mett1e公司）；CP225D型十万分之一电子分析天平（德国赛多利斯公司）；超声波清洗仪［必能信超声（上海）有限公司］；快速开盖万能高速粉碎机（上海市晟喜制药机械有限公司）；硅胶G板（青岛海洋化工厂分厂）；乙腈为色谱纯，水为重蒸馏水，其余试剂均为分析纯。熊果酸对照品（批号：110742-200516）；马钱苷对照品（批号：110726-200521），黄芪甲苷对照品（批号110781-200512），丹参对照药材（批号：120923-200408），麦门冬对照药材（批号：121013-200607）均购自中国药品生物制品检定所。升血颗粒（批号：20090423、20090425、20090524）、阴性对照品（批号：20090528）由甘肃省肿瘤医院制剂室提供。

2 方法与结果

2.1 薄层色谱（TLC）鉴别

2.1.1 山茱萸薄层色谱（TLC）鉴别 取本品6g，加乙醇25mL，加热回流1小时，滤过，滤液蒸干，残渣用石油醚（60～90℃）浸泡2次，15mL/次，倾去石油醚液，残渣加乙醇2mL使溶解，作为供试品溶液。取不含山茱萸的阴性样品6g，按上述方法制备阴性对照溶液。另取熊果酸对照品，加乙醇制成每1mL含1mg的溶液，作为对照品溶液。按照薄层色谱法（《中国药典》2005年版附录VIB），吸取上述3种溶液各10μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷∶三氯甲烷∶乙酸乙酯∶甲酸（20∶5∶8∶0.5）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯（365nm）下检视［7］。结果显示，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上显相同斑点；阴性对照无相应斑点，结果见图1-A。

2.1.2 黄芪薄层色谱（TLC）鉴别 取本品6g，研细，置三角烧瓶中，加甲醇超声提取3次（25、30、30mL），15min/次，过滤，合并滤液，蒸干，残渣加20mL水溶解，置分液漏斗中，用水饱和的正丁醇提取4次（25，25，20，20mL），合并正丁醇液，用氨试液提取3次（20，20，20mL），弃去氨液，正丁醇蒸干，用甲醇溶解并转移至5mL容量瓶内，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。取不含黄芪的阴性样品6g，按上述方法制备阴性对照溶液。取黄芪甲苷对照品，加甲醇制成每1mL含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。按照薄层色谱法（《中国药典》2005年版附录VIB），吸取上述3种溶液各10μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿∶甲醇∶水（30∶10∶1）［8］为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃烘烤约5分钟，至斑点显色清晰。结果显示，供试品色谱中在与对照品色谱相应的位置上，显相同棕色斑点，阴性样品无相应斑点，结果见图1-B。

2.1.3 丹参薄层色谱（TLC）鉴别 取本品6g，加水50mL使溶解，加热煮沸15分钟，过滤，滤液用盐酸调pH2～3，加乙酸乙酯萃取2次，10mL/次，合并乙酸乙酯液蒸干，残渣加乙酸乙酯5mL使溶解，作为供试品溶液。取不含丹参的阴性样品6g，按上述方法制备阴性对照溶液。取丹参对照药材1g，同法制成对照药材溶液。按照薄层色谱法（《中国药典》2005年版附录VIB），吸取上述3种溶液各10μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸（80∶50∶8）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以2％三氯化铁乙醇溶液，105℃烘至斑点显色清晰［9］。结果显示，供试品色谱中在与对照药材色谱相应位置上显相同颜色的斑点，阴性样品无相应斑点，结果见图1-C。

2.1.4 麦门冬薄层色谱（TLC）鉴别 取本品6g，研细，加甲醇30mL，超声处理（功率120W，频率40KHz）30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水20mL、盐酸1mL，加热煮沸5分钟，放冷。用乙醚振摇提取3次，30mL/次，合并乙醚液，挥干，残渣加乙醇1mL使溶解，作为供试品溶液。取不含麦门冬的阴性样品6g，按上述方法制备阴性对照溶液。取麦门冬对照药材2g，加水，煎煮10分钟，滤过，滤液加盐酸1mL同法制成对照药材溶液。按照薄层色谱法（《中国药典》2005年版附录VIB），吸取上述3种溶液各10 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯（3∶2）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇液，在105℃加热至斑点显色清晰［10］。结果显示，供试品色谱中在与对照药材色谱相应位置上显相同颜色的斑点，阴性样品无相应斑点，结果见图1-D。

图1 升血颗粒中山茱萸、黄芪、丹参、麦门冬的薄层色谱图

2.2 含量测定

2.2.1 马钱苷的含量测定

2.2.1.1 色谱条件 色谱柱：Luna C18（4.6mm×250mm，5μm）；流动相：［四氢呋喃∶乙腈∶甲醇（1∶8∶4）］-0.05％磷酸溶液（10∶90），流速：1.0 1mL/min，进样量：10μL，检测波长：236nm，柱温：40℃，理论板数不得低于4000。

2.2.1.2 溶液的制备 精密称取本品6g，研细，加在40％甲醇预洗的中性氧化铝柱（100～200目，4g，内径1.5cm）上，用40％甲醇50mL洗脱，收集流出液及洗脱液，蒸干，残渣用50％甲醇使溶解，转移至10mL量瓶中，加50％甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，用0.45μm微孔滤膜滤过，作为供试品溶液。阴性对照溶液的制备：按处方比例及制备工艺，制备不含山茱萸的阴性对照品，并按照“2.1.1”项制成阴性对照溶液。对照品溶液的制备：取马钱苷对照品适量，加50％乙醇制成每1mL含20μg的溶液，即得［11］。

2.2.1.3 系统适用性实验 吸取供试品溶液、阴性对照品溶液及对照品溶液各10μL，按上述色谱条件进行检测，结果显示供试品中马钱苷峰与对照品峰保留时间一致，并与样品中其他组分达到很好分离，阴性对照品溶液中未出现相对应的峰，见图2。

图2 升血颗粒中马钱苷HPLC色谱图

2.2.1.4 线性关系考察 精密吸取马钱苷对照品溶液（浓度15.04μg/mL）5、10、15、20，25，30μL进样，依“2.2.1.1”项色谱条件测定，以马钱苷峰面积为纵坐标，马钱苷对照品的量为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程C=9.0980×10-7A-3.4701×10-3，r=0.998 1。结果表明，马钱苷在0.075 2～0.451 2μg范围内呈良好的线性关系。

2.2.1.5 精密度 精密吸取马钱苷对照品溶液10μL，重复进样5次，测定马钱苷峰面积，计算相对标准偏差，测得马钱苷峰面积RDS为1.18％。

2.2.1.6 重复性 按“2.2.1”项供试品溶液的制备方法及色谱条件，重复测定同一样品6次，马钱苷含量平均值为0.146mg/g，RSD为2.3％。结果表明本方法重现性好。

2.2.1.7 稳定性 精密吸取供试品溶液10μL，按“2.2.1.1”项色谱条件，于0，2，4，6，8，12，18小时进样，测定马钱苷峰面积，RSD为2.5％。结果表明，供试品溶液在18小时内具有较好的稳定性。

2.2.1.8 回收率试验 精密称取本品3g，共取6份，分别精密加入马钱苷对照品溶液（浓度为0.158mg/mL）1mL，按“2.2.1.1”项方法制备，进样10μL，测定峰面积，计算含量。结果马钱苷平均加样回收率为96.2％，RSD为2.3％，见表1。

表1 回收率试验结果

2.2.1.9 含量限度的确定 为确定升血颗粒中马钱苷的含量限度，对3批次升血颗粒进行了马钱苷含量测定。结果3批样品（20090423、20090425、20090524）中马钱苷含量分别为0.124、0.118、0.120mg/g。

3 讨论

本制剂采用薄层色谱法对方中主药山茱萸、黄芪、党参和麦门冬进行定性鉴别，采用高效液相色谱法对山茱萸所含主要成分马钱苷进行含量测定，能够对方中各主药进行质量控制，实验结果表明，本方法操作简便、专属性强、重复性好、阴性无干扰，所建立的标准可有效控制该制剂的质量。

TLC鉴别实验中，对供试品溶液的制备方法、展开系统、显色剂、硅胶板均做了大量的考察和比较，各供试品色谱图与对照药材、对照品色谱图相应位置上显相同颜色的斑点，供试品各斑点分离清晰，层析效果好，可以达到鉴别的目的。

采用HPLC法测定山茱萸中马钱苷的含量，供试品组分多，成分复杂，故在供试品溶液的制备过程中，直接将研细的样品粉末加在40％甲醇预洗的中性氧化铝柱（100～200目，4g，内径1.5cm）上，用40％甲醇50mL洗脱，收集流出液及洗脱液后作为供试品溶液，基本剔除了其他成分的干扰。使得样品中马钱苷峰形好，与杂质峰分离度高，并且有效除去了马钱苷峰后杂质，使得色谱峰重现性好。

本实验还比较了以甲醇-水［12］，乙腈-水［13］以及［四氢呋喃∶乙腈∶甲醇（1∶8∶4）］-0.05％磷酸溶液的不同比例作为流动相，结果采用［四氢呋喃∶乙腈∶甲醇（1∶8∶4）］-0.05％磷酸溶液（10∶90）为流动相时马钱苷能得到较好的分离；供试溶液中待测组分与相邻组分分离度好，阴性对照无干扰。

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Study on Quality Standard of ShengXue Granules

DAI Xiaoyan1，WANG Yujie1，WEI Xuebing2
1 Gansu Provincial Cancer Hospital，Lanzhou 730050，China；2 Gansu Provincial Institute for Drug Control

Objective：To establish quality control of ShengXue granules.Methods：ShanZhuYu（Cornus officinalis），HuangQi（radix Astragalus），DanShen（radix salviae miltiorrhizae）and MaiMenDong［Ophitopogin japonicum（L.f）Ker.-Gawl.］in ShengXue granules were identified by TLC；the contents of loganin were determined by HPLC.Results：TCL figures were distinct and reproducible，the blank test showed no interference；loganin showed better linear relationship in the range between 0.0752 and 0.451 μg/mL and peak areas（r=0.998 3），average recovery rate was 96.2％，RSD=2.3％（n=6）.Conclusion：The standard could be used in quality control of ShengXue granules.

ShengXue granules；quality control；TLC；HPLC

R282.5

A

1004-6852（2014）01-0031-04

2013-06-27

戴晓雁（1978—），女，主管中药师。研究方向：中药制剂。