血尿酸对大鼠阿尔茨海默病生物标记物表达的影响☆

王君霞 刘庆新 肖新兴

血尿酸对大鼠阿尔茨海默病生物标记物表达的影响☆

王君霞*刘庆新*肖新兴*

目的观察不同血尿酸水平对大鼠阿尔茨海默病生物标记物β-淀粉样肽前体蛋白（amyloid recurosr protein，APP）及β分泌酶-1（beta-site amyloid precursor protein cleaving enzyme-1，BACE1）表达的影响。方法采用腹腔注射氧嗪酸钾盐（oxonic acid Potassiumsalt，OAPS）的方法建立不同水平高尿酸血症（hyperuricemia，HUA）大鼠模型，HE染色观察大鼠海马区形态学变化；Western blot检测海马区APP及BACE1的表达，并进行统计学分析。结果与正常对照组比较，OAPS处理组血尿酸水平明显升高（P＜0.01），海马区APP及BACE1的表达明显上调（P＜0.001），与低剂量组比较，中、高剂量组血尿酸水平升高（P＜0.05），海马区APP及BACE1表达减少（P＜0.05），与中剂量组比较，高剂量组血尿酸水平增高（P＜0.01），高剂量组的大鼠海马组织APP的表达减少（P＜0.05），BACE1表达无统计学差异性（P＞0.05）。结论高于正常水平的血尿酸可能为AD发生或发展的危险因素，其水平越高对AD危险性越低。

高尿酸血症 β-淀粉样肽前体蛋白 β分泌酶-1

阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）是一种起病隐匿的以学习、记忆等认知功能进行性下降为临床特征的中枢神经系统退行性病变疾病。全球AD患者数量每20年增长一倍[1]，AD的确切发病机制仍不明确，认为是多种因素造成的共同结果。近来有研究表明，尿酸（uric acid，UA）在多种中枢神经系统疾病中起重要作用，但UA与AD之间的关系众说纷纭，未有定论。众所周知，UA具有抗氧化和促氧化双重性质，UA对AD是保护因素，还是危险因素，尚待明确。本实验旨在探讨不同水平血尿酸与AD的关系，为预防或治疗AD提供理论及实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物山东大学实验动物中心提供的清洁级Wistar雄性健康大鼠48只，体重（220±10）g，SPF级环境饲养，动物自由饮水与饮食，适应环境1周后进行实验；每周称重2次，根据体重随时调整给药量。

1.2 动物分组与高尿酸血症模型的建立将动物随机分成4组，即正常对照组、低剂量组、中剂量组及高剂量组，每组12只大鼠。OAPS以灭菌蒸馏水配成300、600、900 mg/kg 3种剂量，采用腹腔注射的方法进行，给药体积1 mL/(100g·d)，正常对照组同时间腹腔注射等体积生理盐水，连续给药28d，各组动物均实验条件下自然饮水、饮食。

1.3 血清指标鉴定各组动物分别于实验0、14、28 d采用断尾取血法，采集大鼠血液约1 mL，经室温自然凝血和离心（3000 r/min，15 min）分离后，取上清液200 μL于EP管中，检测血尿酸水平。

1.4 海马区神经细胞形态学观察实验28 d后，各组随机选取6只大鼠进行常规灌注取材，制作石蜡切片，根据大鼠脑立体定位图谱选择海马区连续冠状切片10张，片厚5 μm。常规脱水、二甲苯透明、封片，于光镜下观察海马区神经细胞形态学变化。

1.5 Western blot检测大鼠海马区APP及BACE1的表达水平实验28 d后，各组选6只大鼠，冰上取分离海马组织，用细胞裂解液（碧云天生物技术研究所）提取海马蛋白，使用10%SDS-PAGE分离，Semi-Dry Cell进行半干电泳转移，0.01 mol/L PBS稀释一抗（GAPDH，Sigma，稀释比例1：4000；兔抗APP、BACE1，Bioss，稀释比例均为1：500）4℃温育过夜，加入二抗（Jackson，稀释比例1：2000）室温温育2 h，采用SuperSignal West Pico Chemiluminent Substrates进行化学发光检测，用Gel-Pro Analyzer软件分析处理。GAPDH作为内参。

1.6 统计学方法采用SPSS19.0对数据进行统计描述和分析。计量资料以（±s）表示，四组资料比较采用单因素方差分析，多组间两两比较采用LSD检验。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 各组动物血清尿酸水平的变化实验0 d，各组之间大鼠血UA水平相比较无明显差异性（F= 0.272，P＞0.05），OAPS干预后，于实验14、28 d检测各组大鼠血UA水平出现差异（F=297.737，P＜0.001；F=483.507，P＜0.001），与低剂量组比较，中剂量组及高剂量组的大鼠血UA水平明显升高（P＜0.01）；与中剂量组比较，高剂量组的大鼠血UA水平显著增高（P＜0.05），见表1。

2.2 大鼠海马区形态学变化如图1所示，正常对照组大鼠海马区组织结构正常，神经细胞排列整齐，形态正常，未见明显病理改变。低、中、高剂量组大鼠海马区组织结构异常，神经细胞排列不规则，胞核固缩，染色加深。

2.3 海马组织APP、BACE1的表达各组之间大鼠海马组织APP、BACE1的表达有明显差异性（F1=26.85，P1＜0.001；F2=10.969，P2＜0.001），与低剂量组比较，中剂量组及高剂量组的大鼠海马组织APP、BACE1的表达下调（P＜0.05）；与中剂量组比较，高剂量组的大鼠海马组织APP的表达减少（P＜0.05），BACE1表达无统计学差异（P＞0.05）（见表2和图2）。

表1 各组血清尿酸值的比较(c/mmol·L-1)

3 讨论

到目前为止，AD的发病机制尚不明确，研究发现AD的发生存在多种假说，但均与Aβ脑内异常沉积相关联，Aβ沉积是AD病理改变的中心环节[2]，Aβ是APP经BACE1水解生成。APP是一种在人体的多种组织中广泛表达的跨膜糖蛋白，是构成SP的主要成分Aβ的前体蛋白，当APP的表达升高将会导致Aβ的生成增多。诸多证据显示，Aβ是由BACE1启动生成的，BACE1过表达，活性增强，可以使APP水解生成Aβ增多，导致AD的发生[3-4]，为Aβ生成的关键酶[5]。由此可见，AD的生物标记物Aβ1-42、APP及BACE1的表达增多是AD发生和进行性发展的重要因素。因此，选取Aβ1-42、APP及BACE1作为判断AD发生和发展的生物标记物，能更清晰的说明不同水平血UA与AD的关系。

本研究通过采用腹腔注射OAPS成功复制HUA大鼠模型[6-7]。结果显示，HUA大鼠海马组织APP及BACE1的表达较正常对照组明显上调，随着血尿酸水平的升高，大鼠海马组织APP及BACE1的表达呈下降趋势，中、高剂量组BACE1表达无明显差别。

由此可见，血UA与AD具有密切的相关性，高于正常水平的血UA可以使Aβ生成增多，促进AD的发生或发展，成为AD的危险因素之一，但随着血UA水平的明显升高，Aβ生成相对减少，血UA又可以降低AD的危险性。

现已有大量研究证明，HUA与痛风、高血压、糖尿病、心血管疾病及脑小血管病等多种临床疾病有关[8-9]。因此，血UA的相关研究得到了国内外学者的广泛重视。UA是人体内嘌呤的最终代谢产物，是由嘌呤核苷酸经过一系列反应最终生成。它是一种特有的天然抗氧化剂，保护神经元细胞不被自由基损伤[10]。UA清除体内自由基的作用与维生素C和维生素E相同，他们在血浆中协同发挥抗氧化剂的功能[11]。UA还具有保护DNA、增强免疫功能、维持血压和抗衰老的作用。但是，也有研究表明，UA还具有促氧化特性，溶解状态的尿酸可以通过一系列反应生产自由基，导致脂质过氧化反应的增加[12]。它还可以介导机体氧化应激反应，导致血管内皮的损伤，发挥促氧化性质，我们前期临床研究也证明：血UA水平增高是脑白质病变的独立危险因素[8]。

表2 大鼠海马组织APP、BACE1的表达

图1 各组大鼠海马组织CA1区H＆E染色（400×）

图2 大鼠海马组织APP表达的影响（1：低剂量组，2：中剂量组，3：高剂量组，4：正常对照组）

Annanmaki T等[13]研究表明，低水平的血UA增加帕金森病（Parkinson's isease,PD）的风险性，血UA水平可作为预测认知变化的指标。商秀丽等[14]通过检测30例AD患者和30例健康对照组的血UA水平，研究结果显示，血UA可能是AD的危险因素，血UA水平可能与AD的认知功能有关。这都表明UA与AD的密切关系，结果也证实本实验结论，即高于正常水平的血UA可能促进AD的发生或发展。但血UA对AD的危险性随UA水平升高而降低，以前未见研究报道。

其机制可能与氧化应激有关，提示血UA水平不同，在体内所发挥的作用不尽相同。当血UA水平过高时，UA主要发挥抗氧化特性，可以消除自由基及活性氧避免发生脂质过氧化反应，并可能分解过氧化物阻断过氧化链，减轻大鼠海马组织神经元细胞损伤，起到保护神经细胞作用；当血UA水平过低时，UA主要起促氧化特性，触发氧化应激反应，加重AD的发生或发展，增加AD的危险性。

本研究发现，OAPS处理组大鼠海马组织APP及BACE1表达明显增多，推测血UA可能与AD的发生或发展密切相关，也许为AD的危险因素之一。同时发现不同血UA水平与AD存在量效关系，血UA在一定的范围内对AD的危险性较小，可以改善AD病情的进展，这可能是由UA的抗氧化及促氧化双重性质决定。虽然，我们的实验发现不同的UA对AD具有不同的影响，但对于弄清UA具体剂量范围的作用还需更多的研究，从而调控血UA水平，找到一个最佳浓度范围，使尿酸既可以使AD处于低风险状态，延缓AD病情的进一步发展，同时又可以使其他相关疾病病情稳定，达到最大利益化。这将是我们在以后工作中研究的方向和重点。

[1] 陈健华，唐牟尼，黄若燕，等.广州市城乡养老院≥60岁人群痴呆患者的生存率及相关因素研究[J].中国神经精神疾病杂志，2012，38（11）：646-650.

[2] 王晓楠，胡雪君，杨旸，等.丙酮酸盐对阿尔茨海默病大鼠学习记忆的影响[J].中国神经精神疾病杂志，2014，40（2）： 87-90.

[3] Cavallucci V，D'Amelio M，Cecconi F.Aβ toxicity in Alzheimer's disease[J].Mol Neurobiol，2012，45（2）：366-378.

[4] Hampel H，Shen Y，Walsh DM，et al.Biological markers of amyloid beta-related mechanisms in Alzheimer's disease[J].Exp Neurol，2010，223（2）：334-346.

[5] Li R，LindholmK，Yang LB，et al.Amyloid beta peptide load is correlated with increased beta-secretase activity in sporadic Alzheimer's disease patients[J].Proc Natl Acad Sci U S A，2004，101（10）：3632-3637.

[6] Sánchez-Lozada LG，Soto V，Tapia E，et al.Role of oxidative stress in the renal abnormalities induced by experimental hyperuricemia[J].AmJ Physiol Renal Physiol，2008，295（4）：1134-1141.

[7] 甘志勇，张纯，冯娟，等.尿酸酶在用氧嗪酸建立高尿酸血症模型大鼠体内的降尿酸作用[J].重庆医科大学学报，2010，35（10）：1454-1457.

[8] 刘庆新，王君霞，王媛，等.血尿酸水平与脑小血管病的关系[J].山东医药，2012，52（9）：37-38.

[9] 王超英，何金红.高尿酸血症与高血压、肥胖、高血脂、糖尿病的关系分析[J].实用医学杂志，2010，26（5)：819-821.

[10] Hardy J，Selkoe DJ.The amyloid hypothesis of A lzheimer's disease：progress and problems on the road to therapeutics[J].Science，2002，297（5580）：353-356.

[11] Ames BN，Cathcart R，Schwiers E，et al.Uric acid provides an antioxidant defense in humans against oxidant-and radical-caused aging and cancer：a hypothesis[J].Proc Natl Acad Sci U S A，1981，78（11）：6858-6862.

[12] Bayer TA，Wirths O，Majtényi K，et al.Key factors in Alzheimer's disease：beta-amyloid precursor protein processing,metabolismand intraneuronal transport[J].Brain Pathol，2001，11（1）：1-11.

[13] Annanmaki T，Pohja M，Parviainen T，et al.Uric acid and cognition in Parkinson's disease：a follow-up study[J].ParkinsonismRelat Disord，2011，17（5）：333-337.

[14] 商秀丽，张凤英，孟令慧，等.阿尔茨海默病患者血尿酸水平的检测及意义[J].中国医科大学学报，2009，38（5）：333-334.

The effects of serum uric acid on expression of APP and BACE1 in rats.

WANG Junxia,LIU Qingxin,XIAO
Xinxing.Department of Neurology,Binzhou Medical University Hospital,Binzhou 256600,China.Tel：0535-3399999.

ObjectiveTo observe the effects of the different serumuric acid levels on expression of Alzheimer’s disease biomarkers(APP and BACE1)in rats.MethodsIntraperitoneal injection of oxygen of oxazine acid potassiumwas used to produce HUA models in rats.H&E staining was used to detect the morphological changes of the hippocampus. Western blot was used to detect the protein levels of APP and BACE1 of the hippocampus.ResultsCompared with normal control group,the serumuric acid and the protein levels of APP and BACE1 in the hippocampus was obviously increased at OAPS treatment group(P＜0.01).Compared with lowdose OAPS treatment group,the serumuric acid level was significantly increased whereas the protein levels of APP and BACE1 in the hippocampus were significantly decreased at the middle and high dose group(P＜0.01).Compared with middle dose group,the serumuric acid level was increased at high dose group(P＜0.05)and the expression of APP were decreased in the hippocampus rats but the expression of BACE1 remained unchanged(P＞0.05).ConclusionThe higher level of serumuric acid may be a protective factor of AD. The higher serumuric acid levels,the lower the risk of AD.

Hyperuricemia Amyloid recurosr protein Beta-site amyloid precursor protein cleaving enzyme-1

R742

A

2014-03-17）

（责任编辑：李立）

10.3936/j.issn.1002-0152.2014.08.007

☆山东省高等学校科技计划项目（编号：J12LL04）

*滨州医学院附属医院神经内科（滨州256600）