沉默调节蛋白1促进体外神经元的轴突生长☆

梁海乾 李晓红 王景景 涂悦 陈翀 张赛

·论著·

沉默调节蛋白1促进体外神经元的轴突生长☆

梁海乾*李晓红*王景景*涂悦*陈翀*张赛*

目的 探讨沉默调节蛋白1(Sirt1)对神经元轴突生长的影响。方法体外原代分离培养胚胎海马神经元，观察Sirt1在72 h神经元的分布表达；通过RNAi技术下调Sirt1基因，观察其对72 h神经元轴突长度的影响；通过质粒转染过表达Sirt1基因或药物白藜芦醇(RES)激活Sirt1蛋白，检测其对72 h神经元轴突长度的影响。结果免疫荧光染色结果显示Sirt1位于海马神经元的生长圆锥以及胞体和突起，尤其是轴突末端；与正常对照组(Sirt1正常表达组)相比，Sirt1表达下调可显著缩短72 h海马神经元轴突的长度[由(178.3±3.2)μm缩短到(110.2± 18.30)μm，P＜0.01]；与正常对照组(Sirt1正常表达组)相比，基因过表达Sirt1可显著增加72 h海马神经元轴突的长度[由(178.3±3.2)μm增长到(310.6±39.5)μm，P＜0.01]。与药物对照组(DMSO处理组)相比，药物RES激活Sirt1蛋白亦可显著增加72 h海马神经元轴突的长度[由(292.8±11.2)μm增长到(525.1±49.7)μm，P＜0.01]。结论Sirt1在神经元的轴突生长中起着重要的作用，可作为轴突再生一个潜在的治疗靶点。

Sirt1 轴突生长 白藜芦醇 神经元

沉默调节因子1(silence regulatory proteins1，Sirt1)是第三类组蛋白去乙酰化酶(HDACS)一个典型的家族成员，依赖于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的组蛋白去乙酰化酶[1]，可与许多转录因子相互作用，在细胞核内通过去乙酰化作用调节基因转录，如p53、FOXO家族蛋白、Ku70、NF-κB。Sirt1去乙酰化酶不仅能使组蛋白去乙酰化，还能使p53，FOXO3a，Ku70去乙酰化而具有抗细胞凋亡作用。因此，Sirt1在细胞分化、存活、肿瘤发生和新陈代谢方面起重要作用。有研究报道Sirt1调控神经元的分化[2,3],并通过在海马区的缺血预适应参与神经保护作用[4],在多种神经疾病包括阿尔兹海默病(Alzheimer，s disease,AD)的小鼠模型中能抑制神经退行性变。Sirt1参与多种脑功能的调节，具有神经保护作用。尽管如此，关于Sirt1与轴突生长联系方面的报道是有限的，鉴于此，本文对两者之间的联系进行研究。

1 材料与方法

1.1 研究对象SD孕大鼠购于中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心。GFP和Sirt1单克隆抗体均购自Abcam公司。单克隆抗体Tau-1购自Millipore公司。药物白藜芦醇由Sigma公司提供。罗丹明(红)和俄勒冈(绿)标记的荧光二抗购自Invitrogen公司。eGFP标记的全长Sirt1增强质粒和表达eGFP的抑制Sirt1基因的发卡样小干扰RNA由日本札幌医科大学YoshiyukiHorio博士提供。

1.2 细胞培养、处理及转染原代大鼠胚胎海马神经元根据Li XH等[5]文献所述方法进行细胞培养。提取孕14 d SD大鼠胚胎的海马神经元，并用0.125%不含钙离子与镁离子的Hanks’平衡盐溶液孵育10min，1000 r/min离心5min，置于含有10%胎牛血清的培养基DMEM/F12中。细胞块剪碎分别种植在多聚赖氨酸包被的六孔板中，含5%CO2的37℃温箱中孵育2～4 h后，换加入2%B27和1 mmol/L谷氨酰胺的神经元维持培养基体外培养7 d，每3 d半量换液。神经元用Lipofectamine 2000与质粒或小干扰RNA等比例混合(1:2)，倒置荧光显微镜下细胞转染成功表达绿色荧光蛋白；神经元用药物DMSO和250 nmol/L的白藜芦醇处理后，观察神经元轴突长度的变化。本实验分为两部分，基因调控部分3组：正常对照组(n=6)、转染eGFP-siSirt1组(n=6)和转染eGFP-Sirt1组(n=6)；化学药物处理部分分两组：药物对照组(n=6)和250 nmol/L的白藜芦醇处理组(n=6)。

1.3 免疫荧光染色神经元细胞首先用0.01mol/L的PBS缓冲液冲洗，4%的多聚甲醛固定15min；0.3%细胞破膜剂TritonX-100处理15 min，PBS冲洗2次；0.5%H2O2甲醇溶液孵育10min封闭内源性过氧化物酶；室温下5%的脱脂奶粉封闭非特异性位点；一抗(3%的胎牛血清稀释)孵育4℃过夜，相应的荧光二抗结合，荧光共聚焦显微镜采集图像。

1.4 轴突长度的定量测定神经元轴突长度的测定采用美国NIH图像分析软件。神经元最长的神经突起于体外培养3～5 d时测量。平均的突起长度为图像中总的像素点数减去胞体的像素数除以平均每千分尺轴突的数目和图像中总胞体数。免疫染色的荧光强度通过ImageJ软件分析。

1.5 统计学分析数据应用SPSS 15.0分析，显著性差异采用单因素方差分析(LSD-t检验)和两独立样本t检验，检测水准α=0.05。

2 结果

2.1 Sirt1可位于神经元轴突生长圆锥海马神经元在72 h时用4%多聚甲醛固定，然后采用抗Tau-1抗体行免疫荧光染色(Tau-1显示神经元的轴突)，Sirt1蛋白因携带GFP而显示为绿色。结果显示，Sirt1除了在神经元的胞体和突起表达以外，也可在神经元轴突的生长圆锥中表达(见图1)。

2.2 下调Sirt1基因抑制轴突生长采用eGFP标记的Sirt1干扰RNA(siRNA-Sirt1)质粒转染海马神经元，72 h时通过绿色荧光蛋白与Tau-1(图2，红色)免疫染色测量轴突长度与数目。与正常对照组相比，转染siRNA-Sirt1质粒的神经元，其轴突长度从(178.3±3.2)μm显著缩短到(110.2±18.3)μm (F=157.533，P＜0.01)。

2.3 轴突形成前上调Sirt1基因或激活Sirt1蛋白促进轴突生长表达eGFP-Sirt1或正常对照组的海马神经元培养72 h后固定，进行免疫荧光来标记轴突的标记Tau-1来测量神经元轴突的改变。与正常对照组神经元相比，表达eGFP-Sirt1神经元轴突的长度由(178.3±3.2)μm增长到(310.6± 39.5)μm(F=157.533，P＜0.01)。白藜芦醇处理组的原代海马神经元与药物对照组（DMSO处理）相比，神经元轴突长度由(291.7±13.2)μm增加至(525.1±49.1)μm(t=-4.56，P＜0.01)，见图4。

3 讨论

图1 Sirt1富集于轴突末端的生长圆锥：检测72 h海马神经元发现Sirt1与神经元的标记Tau-1共定位且在整个神经元均有表达，尤其是轴突末端的生长圆锥，如图中1和2所示（上图标尺:10μm，下图1、2分别为上图框内放大图，标尺2μm）

图2 轴突形成前，下调Sirt1基因抑制轴突伸长：检测转染siSirt1基因表达GFP的海马神经元72 h轴突长度，发现下调Sirt1基因可明显阻碍轴突的生长，如图箭头所示（标尺:20μm）

Sirt1可能在神经发育中发挥作用，在高等动物胚胎大脑中就高度表达，在华勒(氏)变性小鼠研究中被证明有神经保护作用，在培养的细胞中也已直接参与对抗应激的神经保护作用。在P25过表达的模型中，Sirt1已被证明具有防止神经退行性变的作用。最近发现Sirt1与微管相关蛋白Tau相互作用。在原代培养的神经元中，降低Tau蛋白的乙酰化作用会增加Sirt1的降解[6]。此外，有研究显示在Sirt1基因敲除小鼠中，Sirt1在增强记忆和适应性方面发挥积极作用[7]。Sirt1介导的自噬作用已为我们所知[8]，例如细胞骨架蛋白Tau的脱乙酰作用与降解[9]。在AD患者脑中伴随神经元轴突的变性Sirt1活性随之下降[10]。所有这些均提示Sirt1在轴突生长与维持方面起关键作用。尽管如此，Sirt1与轴突生成之间的联系还是很不明了。轴突生长是一个复杂的过程。Sirt1介导的轴突生长潜在的机制并不清楚。Sirt1在不同蛋白、不同的生物进程中通过脱乙酰作用而发挥重要作用[4]。

图3 轴突形成前，上调Sirt1基因增加神经元轴突长度：检测转染Sirt1基因表达GFP的海马神经元72 h，发现上调Sirt1基因能明显增加神经元轴突长度并在轴突末端形成功能性结构，如图中1-6所示（1-6为上图框内的放大图，标尺:20μm）

图4 轴突形成前，RES激活Sirt1蛋白可促进神经元轴突的生长：检测Sirt1蛋白激活剂RES处理海马神经元72 h时的轴突长度，发现Tau-1与MAP-2标记的神经元轴突长度明显增长，如图箭头所示（标尺:20μm）

Sirt1位于神经元轴突末端，尤其是轴突生长圆锥，在轴突生成中或许起重要作用。因此，我们研究了位于轴突生长圆锥的Sirt1。首次在极化与未极化的神经元轴突，包括生长圆锥均发现Sirt1的表达。为进一步研究Sirt1在轴突发育中所起得作用，接下来我们应用Sirt1基因敲除的小干扰RNA验证了Sirt1对轴突长出的重要性，进一步证明了Sirt1在轴突发育中的重要性。而后，验证Sirt1基因上调有益于轴突生长。结果提示Sirt1基因的上调在神经元极化建立以前能够刺激功能性轴突发生。在eGFP-Sirt1组我们观察到树突末端的区域同样被Tau-1染色，提示有些树突具备转化成轴突的潜能（图3，1～6）。我们还发现随着轴突的增加树突的数目减少，可能多轴突形成导致了树突的转化。本实验中我们应用药物RES，它是Sirt1的一种激活剂，它能避免神经功能失常而发挥神经保护作用，实验结果发现其能大大促进培养的海马神经元轴突生长。

综上所述，Sirt1在轴突生长中发挥着关键作用，可能是作为轴突相关神经疾病一个潜在的治疗靶点，本实验为我们进一步研究Sirt1与轴突再生的发生机制奠定了基础。

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Silence regulatory protein 1 p romotes axonal ou tgrow th in vitro.

LIANG Haiqian, LI Xiaohong, WANG Jingjing, TU Yue, CHEN Chong, ZHANG Sai.
Institute of Traumatic Brain Injury and Neurology,Brain Hospital ofAffiliated Hospital ofLogisticsUniversity ofChinese People's Armed Police Forces,Tianjin 300162,China.Tel:022-60577101.

ObjectiveTo investigate the effectofsilence regulatory protein 1(Sirt1)on axonal outgrowth.MethodsThe hippocampal neuronswas first isolated in vitro from ratembryos.The distribution and expression of Sirt1 were then detected 72 h later.The down-regulation of Sirt1 was induced by RNAi technology and up-regulation of Sirt1 was induced by overexpression of Sirt1 and resveratrol(RES).Immunofluorescence staining was used to examine the axon length.ResultsImmunofluorescence staining showed that Sirt 1 was located in neuronal cell body and neurite,especially in the distal axons.Down-regulation of Sirt1 significantly decreased axonal length compared with siRNA control group [(178.3±3.2)μm vs.(110.2±18.30)μm,P＜0.01];Overexpression of Sirt1 significantly increased axonal length compared with eGFP controlgroup[(178.3±3.2)μm vs(310.6±39.5)μm,P＜0.01];Activation of Sirt1 by RES treatmentalso significantly increased axonal length compared with vehicle control group(DMSO treated group)[(291.7±13.2)μm vs. (525.1±49.1)μm,P＜0.01].ConclusionsSirt1 plays a key role in axonal growth whichmay be used asa potential therapeutic targetofaxon regeneration.

Sirt1 Axon growth Resveratrol Neuron

R741

A

2013-11-07）

（责任编辑:甘章平）

10.3936/j.issn.1002-0152.2014.06.001

☆国家自然科学基金资助项目（编号：81271392，81301050，81341113），武警后勤学院资助项目（编号：WHB201212），中国博士后基金（编号：2013M542583）

*脑创伤与神经疾病研究所，武警后勤学院附属医院脑科医院(天津300162)