刺玫根不同提取物体外抗氧化能力研究

刘 晶，邸子真，王光函，尤献民

(辽宁省中医药研究院，辽宁 沈阳 110034)



刺玫根不同提取物体外抗氧化能力研究

刘 晶，邸子真，王光函，尤献民*

(辽宁省中医药研究院，辽宁 沈阳 110034)

目的：初步探讨刺玫根不同极性提取物的体外抗氧化活性。方法：采用分光光度法测定刺玫根不同极性提取物的总还原性，及其对DPPH自由基、羟自由基、超氧阴离子的清除作用。结果：建立了刺玫根不同极性提取物的总还原性曲线和DPPH自由基、羟自由基、超氧阴离子抑制曲线。结论：初步明确了刺玫根不同极性提取物的抗氧化能力，其萃取后的乙酸乙酯、正丁醇提取物抗氧化能力有所增强。

刺玫根；提取物；体外抗氧化活性

刺玫根为蔷薇科植物山刺玫RosadavuricaPall.的根，又名刺葛蔷薇根、野玫瑰根，广泛分布于黑龙江、吉林、辽宁、内蒙古、河北、山西等地，资源丰富。该药具有止血及广谱抗菌作用，可用于治疗经血不止、功能性子宫出血、肠炎、细菌性痢疾和肾炎等疾病[1]。本研究在水提取刺玫根后，用不同极性的有机溶剂萃取水提液[2]，得到刺玫根不同极性的有效成分，对其进行体外抗氧化实验，为研究刺玫根的抗氧化作用提供依据。

1 仪器与试剂

仪器：721型分光光度计(山东高密彩虹仪器有限公司)，旋转蒸发仪(上海亚容生化仪器厂)，恒温水浴锅(江苏省金坛市环宇科学仪器厂)，KQ-250DB型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

试剂：DPPH、2，6-二叔丁基对甲酚 (BHT)、抗坏血酸 (VC)、还原型辅酶I(NADH I)、氮蓝四唑(NBT)、酚嗪硫酸甲酯(PMS)、没食子酸、番红均为sigma公司产品；铁氰化钾、三氯乙酸、FeCl3、EDTANa2、FeSO4·7H2O、H2O2均为分析纯，购于沈阳试剂一厂。

2 方法与结果

2.1 不同极性供试品溶液制备

取药材2kg，劈碎，浸泡半小时，加10倍量水提取2次，每次2h，浓缩至1g/mL药液，取1 000mL提取液蒸干，得刺玫根水提物。剩余药液加等量95%乙醇放置过夜，虹吸上清液，沉淀干燥得到刺玫根醇沉物。上清液回收乙醇至无醇味，加水至1 000mL，加入等量乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，回收乙酸乙酯至干，加入适量70%乙醇溶解，糊精拌样，得到刺玫根乙酸乙酯提取物(1∶20)；萃取后水提液加入等量正丁醇，萃取4次，合并萃取液，回收正丁醇至干，加入适量70%乙醇溶解，糊精拌样，得到刺玫根正丁醇提取物(1∶10)。将不同极性提取液分别配置成适当浓度梯度系列溶液，备用。

2.2 不同提取物清除DPPH自由基测定[3-4]

DPPH是一种很稳定的以氮为中心的自由基，若提取物能将其清除，则表明该提取物能降低烷基自由基浓度，阻断脂质过氧化链反应。分别取不同浓度供试液2mL，加入0.1mmol/DPPH溶液2mL，涡旋混匀后，室温放置30min，于517nm波长下测定吸光度值，计算抑制率，计算公式为：(A对-A样)/A对×100%。以VC为阳性对照，95%乙醇为空白，以95%乙醇代替药液。以清除率为纵坐标，以浓度(μg/mL)为横坐标作图，所得清除曲线如图1所示。相近浓度下乙酸乙酯层和正丁醇层的DPPH自由基清除能力均优于阳性对照VC。

图1 不同浓度提取物DPPH自由基清除曲线

2.3 不同提取物对超氧阴离子清除作用[5]

超氧阴离子自由基可将NBT还原为蓝色物质，其在560nm波长处有吸收。利用该原理，分别在试管中加入259μmol/L NADH I溶液0.9mL、163μmol/L NBT溶液0.9mL、52.8μmol/L PMS溶液0.3mL，后立即加入不同浓度样品0.3mL，涡旋混匀后，室温放置5min，于560nm波长下测定吸光度.(空白不加PMS，对照不加样品)，计算抑制率,计算公式为(A对-A样)/A对×100%。以没食子酸为阳性对照，以清除率为纵坐标，以浓度(μg/mL)为横坐标作图，清除曲线如图2所示。在相近浓度下，乙酸乙酯层和正丁醇层对超氧阴离子的清除能力均优于阳性对照没食子酸。

图2 不同浓度提取物超氧阴离子自由基清除曲线

2.4 不同提取物抑制羟自由基作用[6-7]

在生命代谢过程产生的自由基中，OH·是最活泼的活性氧，氧化能力极强。本实验采用Fenton法测定不同极性提取物溶液对羟自由基的抑制作用。本实验的原理为H2O2与Fe2+作用产生羟自由基，可使番红褪色，减小其在520nm下的吸光度。各管中分别加入0.02mol/L pH7.4的磷酸盐缓冲溶液1.5mL、520μg/mL番红300μL、2mmol/L EDTANa2-Fe2+200μL、不同浓度的样品，最后加入6%H2O2200μL，混匀后40℃水浴40min，于517nm下测定吸光度(空白以蒸馏水代替药液，对照以蒸馏水代替EDTANa2-Fe2+和药液)，计算抑制率，计算公式为(A样-A空)/(A对-A空)×100%。以VC为阳性对照，以清除率为纵坐标，以浓度为横坐标作图，清除曲线如图3所示。正丁醇、水层、乙酸乙酯层对羟自由基的抑制作用均优于阳性对照VC。

图3 不同浓度提取物羟自由基清除曲线

2.5 不同提取物总还原性测定[8]

铁氰化钾被还原为亚铁氰化钾后，可与三氯化铁作用，生成亚铁氰化铁，在700nm处可测定其吸光度，吸光度值越大，表明其还原性越强。取不同浓度供试液各1mL，分别与2.5mL磷酸缓冲液混合后，加入2.5mL 1%铁氰化钾，置于50℃水浴锅中加热20min，再加入1mL 10%三氯乙酸，混匀后取上清液2.5mL，加蒸馏水2.5mL和0.1% FeCl30.5mL，于700nm波长处测定吸光度。以VC为阳性对照，以吸光度为纵坐标，以浓度为横坐标作图，总还原曲线如图4所示。在相近浓度下，正丁醇层的总还原性均优于阳性VC，乙酸乙酯层总还原性与VC接近。

图4 不同浓度提取物总还原性曲线

3 结论

山刺玫为蔷薇科植物，广泛分布于黑龙江、吉林、辽宁、内蒙古、河北、山西等地，资源丰富，其根、花和果实均可入药。目前对山刺玫的研究多集中在刺玫果上，对刺玫根的研究较少。本实验首次对刺玫根及其不同极性提取物进行了系统的抗氧化活性研究。

刺玫根不同极性提取物对自由基的清除作用均表现出一定的浓度依赖性，但在清除DPPH自由基、羟自由基、超氧阴离子试验中，当浓度升高到一定程度后，其清除率不再随着浓度的增大而增大，而是进入了一个平台期。

本试验中，根据极性的不同，采用不同溶剂萃取法，将刺玫根水提物划分为不同极性有效部分，分别进行抗氧化试验。在清除DPPH自由基试验中，其清除能力大小依次为乙酸乙酯层、正丁醇层、醇沉层、水层；在清除超氧阴离子试验中，其清除能力大小依次为正丁醇层、乙酸乙酯层、醇沉层、水层；在抑制羟自由基试验中，其抑制能力大小依次为正丁醇层、水层、乙酸乙酯层、醇沉层；在总还原性试验中，其还原能力大小依次为正丁醇层、乙酸乙酯层、水层、醇沉层。在不同的抗氧化试验中，不同提取物的抗氧化能力大小有所差异，造成该现象的原因可能是萃取法只是根据极性对刺枚根中的有效成分进行大致分类，每一层中仍含有多种有效成分。进行不同抗氧化活性实验时，每种成分发挥的作用大小不同，所以累积起来表现出的综合效果也有所不同。但总体来说，经过萃取后，正丁醇层和乙酸乙酯层提取物的抗氧化能力均有较大提高，甚至超过了阳性对照品。该实验为刺玫根中抗氧化活性物质的进一步提取分离指明了方向。

[1] 谢晓燕,贡济宇,王立岩.山刺玫根的生药学研究[J].时珍国医国药,2007,18(9):2112-2113.

[2] 徐正斌,郭秀芳,史久良.刺玫根治疗慢性气管炎有效部位的探讨[J].黑龙江医药,1983(3):51-52.

[3] 师梅梅,杨建雄.龙血竭胶囊的体外抗氧化研究[J].中成药,2007,29(11):1591-1594.

[4] 王辉,孙春艳,刘刚.异心莲的体外抗氧化活性[J].中国生化药物杂志,2005,26(1):21-23.

[5] 管福琴,刘敏,单宇,等.灰毡毛忍冬中五环三萜类化合物的抗氧化活性研究[J].时珍国医国药,2013,24(6):1315-1317.

[6] 莫正昌,邓 靖,汲广全,等.鹿蹄草提取物体外抗氧化活性评价[J].食品科学,2010,31(3):19-20.

[7] 崔月花,章克昌.灵芝三萜皂苷( GCTL1) 的体外抗氧化作用[J].食品科学,2010,31(19): 49-51.

[8] 谢广发,朱成钢,胡志明,等.黄酒的体外抗氧化及其机理研究[J].食品与发酵工业,2005,31(10):5-9.

(责任编辑：尹晨茹)

Study on Anti-oxidation Activity in Vitro ofRosadavuricaPall.Extracts

Liu Jing,Di Zizhen,Wang Guanghan,You Xianmin*

(Liaoning Traditional Chinese Medicine Institute, Shenyang 110034,China)

Objective:Discuss the anti-oxidation effects in vitro ofRosadavuricaPall. extracts. Methods:The anti-oxidation effects ofRosadavuricaPall. extracts were determined by The UV spectrophotometry. the anti-oxidation effects in vitro were analyzed by different assay such as total reducing power,DPPH radical scavenging assay,hydroxyl radical scavenging assay and superoxide radical scavenging assay. Results:Obtained the curve of total reducing power,DPPH radical,hydroxyl radical and superoxide radical scavenging respectively. Conclusion:Initially clear the anti-oxidation activity in vitro ofRosadavuricaPall. The Anti-oxidation Activity in Vitro of Ethyl acetate and Butanol Extracts were strengthened.

RosadavuricaPall.;Extracts;Anti-oxidation Effects in Vitro

2014-02-17

国家“十二五”重大新药创制项目(2012ZX09303-017)

刘晶(1980-)，女，硕士，辽宁省中医药研究院助理研究员，研究方向为中药新药开发。

尤献民(1964-)，男，辽宁省中医药研究院研究员，研究方向为中药质量控制。E-mail：18940158727@126.com。

R285.5

A

1673-2197(2014)10-0030-02