麸曲糖化酶活力测定方法探讨

罗惠波，王 毅，边名鸿，杨晓东，杨建勤

(1.四川理工学院生物工程学院，四川 自贡 643000;2.酿酒生物技术及应用四川省重点实验室，四川 自贡 643000;3.江安县工业园区管理委员会，四川 江安 644200;4.成都新忆坊商贸有限公司，成都 610036)

糖化酶(Glucoamylase，EC 3.2.1.3.)是一种外切型糖苷酶，作为白酒微生物代谢过程主要代谢产物之一，其活力大小是衡量麸曲质量的重要指标［1-3］。糖化酶能按顺序水解淀粉或淀粉类似物非还原端的多种糖苷键而生成葡萄糖［4］，因此被广泛运用于食品工业中。常规测定糖化酶活力方法有次碘酸盐法、Schoorl法(DU法)、快速滴定法和3，5-二硝基水杨酸(DNS)法等，但各个测定方法均有一定的缺陷［5-8］。

本文采用微量连续流动分析仪对DNS法进行改进，利用导管取样，运用分光光度计的原理，通过电脑软件自动检测样品含量［9-10］，并与次碘酸盐法、快速滴定法进行比较，以期建立检测麸曲糖化酶活力准确、实用、快速、简便的新方法，并为麸曲生产的规范化提供数据与理论支持，更好的指导麸曲生产。

1 材料和方法

1.1 材料与仪器

材料:麸曲，由酿酒生物技术及应用四川省重点实验室提供;糖化酶(酶活力100000 U/g)，上海蓝季科技发展有限公司。

试剂:MgSO4、KH2PO4、NaNO3、醋酸、醋酸钠、葡萄糖、3，5-二硝基水杨酸(DNS)等均为分析纯，购于成都科龙化工试剂厂。

仪器与设备:UV-2000紫外可见分光光度计(上海尤尼柯有限公司);连续流动化学分析仪(Micro-CFA)(美国Astoria Pacific International);恒温水浴锅(北京中兴伟业仪器有限公司);pH计(上海精密科学仪器有限公司)。

1.2 固态发酵培养

称取10 g 的麸皮，加水 8%(v/m)，KH2PO40.02 g，MgSO40.02 g，NaNO30.3 g，在250 mL 三角瓶中润料2 h后，121℃灭菌30 min，趁热摇散，冷却至40℃左右，接入0.3%(m/m)麸曲，混合均匀，于温度30℃、湿度95%，培养 48 h［11］(22 h 时进行扣瓶)。

1.3 粗酶液的制备

发酵结束后，加入40℃水170 mL。然后加入20 mL pH4.6的醋酸-醋酸钠缓冲溶液，搅匀，40℃保温浸泡1 h，保温时每隔10 min搅拌1次。用脱脂棉过滤，弃去初滤液，得澄清滤液待用［11］(滤液应尽快分析，若30 min内不能使用，应将滤液暂置冰箱中冷藏，分析时升温至40℃后使用)。

1.4 检测方法

1.4.1 酶活力测定方法

次碘酸盐测定糖化酶活力［5］。

快速滴定法测定糖化酶活力［7］。

3，5-二硝基水杨酸法测定糖化酶活力［8］。

1.4.2 连续流动化学分析仪检测

在传统3，5-二硝基水杨酸(DNS)法的基础上，结合美国(API)连续流动化学分析仪，对麸曲糖化酶和标准糖化酶活力进行测定(图1)。

图1 糖化酶活力测定连接示意图

1.4.3 葡萄糖标准曲线测定

浓缩标准液(10 g/L):称取1 g葡萄糖溶于100 mL蒸馏水，需存于棕色瓶內，4～6℃保存，备用。

葡萄糖标准液梯度稀释:将浓缩标准液进行梯度稀释，稀释浓度见表1。

表1 葡萄糖标准液

1.4.4 糖化酶酶液的制备

称取1.1366 g糖化酶，溶于200 mL蒸馏水中，配得的糖化酶活力为568.3 U/mL，4～6℃保存，备用。

1.5 数据分析

应用SPSS 17.0统计软件对不同方法测定的糖化酶活力与准确度进行t检验分析。结合F-检验双样本方差分析，分析测定麸曲糖化酶活力的最佳方法。

2 结果与分析

2.1 不同方法测定糖化酶活力

采用不同方法对糖化酶的活力进行测定，通过t检验分析结果见表2。

表2 不同方法测定糖化酶活力分析

由表2可知，采用不同方法测定糖化酶活力其准确度有较大的差异。通过误差和均值分析可知，次碘酸盐的差值最小，说明次碘酸盐有较高的准确度;而DNS法的差值最大，准确度最低。从RSD值也可以看出，次碘酸盐法的RSD值为3.6%，较快速滴定法和DNS法准确度高。

通过t检验，采用次碘酸盐法和DNS法测定糖化酶活力，t值分别为2.118 和2.317，均小于t(0.025，4)=2.776。双尾概率分别为 0.102 和 0.081，均大于 0.05。所以采用次碘酸盐法和DNS法测定糖化酶活力无显著性的系统误差。而采用快速滴定法测定糖化酶活力时，t=3.293 ＞ t(0.025，4)=2.776，双尾概率 0.03 ＜0.05，说明采用快速滴定法测定糖化酶活力的结果有显著性的系统误差。

2.2 不同方法测定麸曲糖化酶活力

采用不同方法对麸曲糖化酶的活力进行测定，通过F检验分析结果见表3。方差分析结果见表4。

表3 不同方法测定麸曲糖化酶活力分析

由表3可知，通过误差分析，不同方法测定麸曲糖化酶活力有相对误差，且次碘酸盐法测定结果误差值最小，RSD为3.7%。快速滴定法和DNS法测定的结果都有较大的误差，影响的因素可能是测定结果的判定和操作引起的。

表4 不同方法测定糖化酶活力方差分析

由表4可知，通过F-检验双样本方差分析，三种测定方法相互比较，其结果是P值均大于0.05，即三种测定结果的精密度没有显著性。

2.3 DNS法优化探讨

2.3.1 标准曲线的测定

将梯度葡萄糖溶液通过连续化学分析仪进行检测，并利用一次曲线对标准曲线进行拟合，结果图2所示。

图2 还原糖含量测定标准曲线

将DNS法应用到连续流动化学分析仪中，进行还原糖的测定，由图2可知，采用DNS改进法测定还原糖的标准曲线回归方程为:y=0.001045x-0.028，R2=0.9997。所以，在还原糖标准液浓度测定范围内，标准曲线线性良好，符合检测要求。

2.3.2 DNS优化法测定糖化酶活力

采用DNS优化法测定糖化酶活力，通过t检验分析结果见表5。

表5 DNS优化法测定糖化酶活力分析

由表5可知，通过t检验，采用DNS优化法测定糖化酶活力 t=1.806 ＜ t(0.025，4)=2.776，双尾概率为0.145＞0.05，所以采用DNS优化法测定无显著性的系统误差。

2.4 对比试验

对比次碘酸盐法、快速滴定法和DNS改进法测定麸曲糖化酶活力的结果见表6。DNS优化法方差分析结果见表7。

表6 对比试验结果

表7 DNS优化法方差分析结果

由表6可知，经F-检验双样本分析，采用DNS优化法测定麸曲糖化酶活力，与快速滴定法和DNS法方差比较，P 值分别为 0.031 和 0.036，均小于 0.05;同时 F值均小于1，即DNS优化法较快速滴定法和DNS法精密度有显著提高。DNS优化法较次碘酸盐法精密度没有显著性差异，但误差减小。

3 结束语

通过t-检验，采用次碘酸盐法和DNS法测定糖化酶活力，t值分别为2.118 和2.317，均小于 t(0.025，4)=2.776，双尾概率分别为 0.102 和0.081，均大于 0.05，所以采用次碘酸盐法和DNS法测定糖化酶活力无显著性的系统误差。而采用快速滴定法测定糖化酶活力时，t=3.293 ＞ t(0.025，4)=2.776，双尾概率 0.03 ＜0.05，说明采用快速滴定法测定糖化酶活力的结果有显著性的系统误差。通过t-检验可知，采用DNS优化法测定无显著性系统误差。

通过F-检验双样本方差分析，采用次碘酸盐法、快速滴定法和DNS法三者比较，其F-检验的P值均大于0.05，即三种测定结果的精密度没有显著性。DNS优化法与次碘酸盐法、快速滴定法、DNS法进行双样本方差分析，DNS优化法与快速滴定法、DNS法比较，其精密度有显著提高，而与次碘酸盐法没有显著性差异。

改进后的DNS法在操作上更加简便、人为因素影响小，在处理样品较多的时候优势明显。同时，DNS改进法为后续麸曲及麸曲酿造过程中糖化酶活力的分析检测奠定了基础。

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