微柱凝胶卡式法与试管法在ABO新生儿溶血病检测中的对比分析

钟水权

【摘要】 目的：探讨微柱凝胶卡式法对新生儿溶血病（HDN）的诊断价值。方法：选取2012年7月-2013年7月本院儿科收治的疑似ABO母婴血型不合新生儿溶血病的278例新生儿血标本，分别用微柱凝胶卡式法和传统试管法进行直接抗人球蛋白试验、间接抗人球蛋白试验和放散试验，并对检测结果进行比较。结果：278例中临床确诊263例。微柱凝胶卡式法的直接抗人球蛋白试验阳性率76.4%明显高于试管法的59.3%，抗体游离试验阳性率90.5%明显高于试管法的66.2%，抗体放散试验阳性率99.2%明显高于试管法的79.1%，差异均有统计学意义（P<0.001）。结论：微柱凝胶卡式法对于辅助诊断HDN优于传统试管法，操作简单，耗时短，结果易观察，值得在临床上推广。

【关键词】 微柱凝胶卡式法； 试管法； ABO； 新生儿溶血病

新生儿溶血病（Hemolytic disease of the newborn，HDN）是指母婴血型不合引起的胎儿或新生儿免疫性溶血性疾病[1]。临床上其实验诊断依据主要是“三项试验”，即红细胞抗人球蛋白试验、血清游离抗体试验和抗体放散试验[2]。三项试验主要是检测新生儿血清中是否含有红细胞抗体或红细胞是否致敏，提高三项试验的敏感性及特异性，对优生优育和新生儿溶血病的早期准确诊断有十分重要的意义[3]。微柱凝集试验作为一种免疫学检测的新技术，是一种新的改良抗球蛋白试验技术，在发达先进的国家已成为常规的血清学检测技术，近年来在我国输血领域已逐步作为常规应用。本院2012年7月-2013年7月采用微柱凝胶卡式法及传统试管法对拟诊的278例ABO血型不合新生儿溶血病患儿进行平行检测，并进行比较分析，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 血标本来自2012年7月-2013年7月在本院儿科初步诊断疑似ABO母婴血型不合新生儿溶血病的278例患儿。新生儿出生时间0.5～7 d，平均（4.8±2.5）d，其中男142例，女136例。患儿多在出生后1～7 d内，临床表现为出现黄疸和贫血、高胆红素血症、血红蛋白降低，伴有新生儿溶血病的临床症状和体征。

1.2 仪器与试剂 标准抗A、B血清试剂和标准A、B、O红细胞由上海血液生物医药有限公司生产，多特异性抗人球蛋白试剂、单特异性抗-IgG、单特异性抗-C3购于上海市血液中心。微柱凝胶检测卡、试剂、37 ℃免疫微柱孵育器、低速离心机、加样机及自动判读机由达亚美公司提供。

1.3 方法 首先分别鉴定母亲及新生儿抗凝血作ABO及Rh血型，然后对患儿血标本分别应用微柱凝胶卡式检测法及流式细胞仪法进行HDN三项试验，即直接抗人球蛋白试验（DAT）、抗体游离试验及抗体放散试验，同时设立阴、阳性对照，进行质控。

1.3.1 试管法 HDN三项试验严格按照《临床输血技术规范》进行操作。具体步骤：将受检红细胞用生理盐水洗涤3次，配成3%～5%的红细胞悬液。取红细胞悬液1滴加广谱抗人球蛋白试剂2滴，离心观察结果（直抗试验）；取试管3支，分别标记A、B、O，每管加入患儿血清/放散液2滴，按标记分别加入A、B、O试剂红细胞1滴，37 ℃孵育1 h后，用生理盐水洗3次，加入抗人球蛋白试剂2滴，离心观察结果（游离/放散试验）。

1.3.2 微柱凝胶卡式法 （1）直接抗球蛋白试验：取新生儿静脉血，离心，取压积红细胞，用生理盐水洗涤3次后配制成约0.5%～1%的红细胞悬液，取50 μL红细胞悬液加入微柱凝胶孔，离心5 min（2000 r/min），判读结果，微柱凝胶卡式法以红细胞聚集在凝胶带上部或凝胶中部为阳性反应。（2）血清游离抗体试验：取微柱凝胶卡在相应位置分别加入标准A、B、O红细胞各50 μL，再各加入患儿血清50 μL，置37 ℃孵育15 min，离心10 min（2000 r/min），判断结果，阳性同上。（3）释放试验（热放散法）：取洗涤4次的压积红细胞500 μL置试管中，加等量生理盐水，放入56 ℃水浴中孵育10 min，取出后立即离心（2000 r/min）5 min取上清液即为放散液，在微柱凝胶孔上分别加入标准A、B、O红细胞各50 μL，随后各加入放散液50 μL，将此卡置孵育器37 ℃孵育15 min，取出放入低速离心机离心3 min（1500 r/min），判定结果，阳性同上。

1.4 HDN检验判断标准 3项试验同时阳性可确诊；不同时阳性时以放散试验阳性为诊断标准；直接抗球蛋白试验和/或血清游离抗体阳性，而放散试验阴性，结合临床具体分析[4]。

1.5 HDN临床诊断标准 （1）母婴血型不合；（2）曾有死胎或有分娩原因不明的黄疸、贫血、水肿儿史；（3）新生儿有不同程度的黄疸、贫血、肝脾肿大，出生后2 d内有黄疸，2～4 d达高峰，血清胆红素>205 μmol/L，有高胆红素血症的为临床型，否则为亚临床型。（4）实验室诊断：新生儿直接抗球蛋白试验、血清游离抗体试验、放散试验3项中至少有一项阳性。（5）排除乙型肝炎病毒感染等继发疾病[5]。

1.6 统计学处理 采用SPSS 19.0软件对所得数据进行统计分析，计数资料采用 字2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

278例临床表现为贫血、高胆红素血症、临床疑似HDN的患儿血标本中，最后综合分析临床确诊263例。确诊263例中，试管法的抗体放散试验阳性者208例（79.1%），漏诊55例，HDN与临床符合率为79.1%（208/263）。微柱凝胶卡式法的抗体放散试验阳性者261例（99.2%），漏诊2例，HDN与临床符合率为99.2%（261/263）。微柱凝胶卡式法的直接抗人球蛋白试验阳性率76.4%明显高于试管法的59.3%，抗体游离试验阳性率90.5%明显高于试管法的66.2%，抗体放散试验阳性率99.2%明显高于试管法的79.1%，差异均有统计学意义（P<0.001）。另试管法检测结果的凝集强度为±～+，而微柱凝胶卡式法为+～++，比试管法的凝集强度高1+～2+，具体见表1。endprint

3 讨论

新生儿溶血病是由于母亲体内存在着与胎儿红细胞不合的IgG血型抗体而引起的同种免疫疾病。新生儿溶血病机理是母体的IgG抗体通过胎盘屏障进入胎儿血液中，对胎儿的红细胞进行破坏，造成不同程度的溶血、贫血、黄疸及高胆红素血症等，可引起流产、死胎、死产等，存活的婴儿严重者可导致新生儿严重后遗症如严重贫血、胆红素脑病及智力低下，甚至死亡等[6]。在已知的血型系统中，以ABO血型系统最常见。原因为A、B血型抗原物质广泛存在自然界某些植物、寄生虫及细菌等微生物中，O型血孕妇通常在怀孕前早已接触过A、B血型抗原物质刺激，并可产生相应的不同效价的抗A、抗B的IgG抗体，ABO血型不合50%在第一胎即可发病，因此ABO新生儿溶血病临床多见[7]。其次Rh血型系统，Kell、MN、Duffy等其他系统的血型不合在临床上比较为少见。目前临床上可根据“三项试验”，即红细胞抗球蛋白试验、抗体放散试验和血清游离抗体试验，并结合临床，综合分析做出诊断。然而新生儿是人生长发育一个特殊阶段，新生儿溶血病虽与新生儿血型密不可分，但其血型抗原位点少，抗原表达弱，抗体水平表达较低，尤其是出生3～4个月时的生理性低γ球蛋白血症，IgG水平仅相当于成人的35%左右，1～3岁时IgG水平也仅为成人的60%，13岁时才基本达到成人水平[8]。鉴于以上原因故血型血清学检测的难度较大，既往通常采用盐水抗球蛋白试验、酶处理红细胞技术等传统方法及手工聚凝胺试验来测定，操作繁琐，时间长，同时需显微镜观察，误差大，主观因素掺杂，不易标准化，且准确率不高[9]。

本院2012年7月-2013年7月采用微柱凝胶卡式法及传统试管法对拟诊的ABO血型不合新生儿溶血病进行平行检测，结果显示微柱凝胶卡式法检出直接抗人球蛋白试验阳性率、抗体游离试验阳性及抗体放散试验阳性率明显高于试管法，临床符合率达99.2%，两法差异有统计学意义，与既往文献[10]报道相符。分析差异原因，与采用的试验方法有关。微柱凝胶卡式法是建立在传统血清学基础上的一项免疫学血型检测技术，是抗原抗体反应、凝胶柱过滤和离心三种技术的集成与结合[11]。原理为当抗原抗体发生反应，红细胞发生凝集，离心时，凝集块不能通过凝胶间隙而留在凝胶上层，呈阳性反应，未凝集细胞离心是可通过凝胶间隙而留在凝胶下层，呈阴性反应。微柱凝胶技术直观、敏感、快速、特异性更好，结果更易于观察。而试管法操作过程中需反复洗涤红细胞，步骤繁琐，受人为因素影响大，结果判断主观化，且试验过程中干扰因素较多，如在放散试验中，试验的温度、酶的pH值，酶化时间等不易把握，容易造成假阳性、假阴性。总之，传统试管法由于时间长、重复性不好等缺点，因此也一直不能被临床广泛推广使用，而微柱法操作过程简单、耗时短、结果易观察，尤其表现在放散试验和游离试验中，易标准化，适宜在临床推广应用。

参考文献

[1]张勇萍，安宁，李娜，等.微柱凝胶法与试管法检测新生儿溶血病免疫性抗体的比较[J].临床血液学杂志：输血与检验，2012，24（6）：697-698.

[2]符宝铭，石明芳，袁茜茜.新生儿溶血病壮族患儿ABO溶血三项试验检测结果分析[J].国际检验医学杂志，2012，33（6）：704-705.

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[4]王宇宏，刘冰.用微柱凝胶法诊断新生儿溶血病的实验研究[J].中国实验诊断学，2012，15（12）：2018-2020.

[5]张志哲，黄青枝，吴会红，等.应用ROC曲线评价产前IgG抗A（B）效价检测对早期诊断ABO新生儿溶血病的价值[J].检验医学，2011，26（5）：338-339.

[6]朱莹，王婧.微柱凝胶技术检测521例O型血孕妇IgG A（B）抗体效价[J].检验医学与临床，2013，10（1）：33-34.

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[8]李明锋，谭代林，伍万刚，等.4种血型血清学检测方法在婴幼儿患者临床输血中的比较与研究[J].基层医学论坛，2007，11（1）：35-36.

[9]李娟，方代华，许琴，等.微柱凝胶技术在新生儿同种免疫性溶血病诊断中的临床应用[J].中国实用医刊，2013，40（15）：56-57.

[10]王萍，肖筠，魏红璐.微柱凝胶法和传统试管法在新生儿溶血病诊断中的比较研究[J].中国计划生育学杂志，2012，20（8）：548-549.

[11]马吉联.微柱凝胶技术在新生儿溶血性疾病诊断的研究[J].世界最新医学信息文摘（电子版），2013，13（7）：64-65.

（收稿日期：2014-01-20） （本文编辑：欧丽）endprint

3 讨论

新生儿溶血病是由于母亲体内存在着与胎儿红细胞不合的IgG血型抗体而引起的同种免疫疾病。新生儿溶血病机理是母体的IgG抗体通过胎盘屏障进入胎儿血液中，对胎儿的红细胞进行破坏，造成不同程度的溶血、贫血、黄疸及高胆红素血症等，可引起流产、死胎、死产等，存活的婴儿严重者可导致新生儿严重后遗症如严重贫血、胆红素脑病及智力低下，甚至死亡等[6]。在已知的血型系统中，以ABO血型系统最常见。原因为A、B血型抗原物质广泛存在自然界某些植物、寄生虫及细菌等微生物中，O型血孕妇通常在怀孕前早已接触过A、B血型抗原物质刺激，并可产生相应的不同效价的抗A、抗B的IgG抗体，ABO血型不合50%在第一胎即可发病，因此ABO新生儿溶血病临床多见[7]。其次Rh血型系统，Kell、MN、Duffy等其他系统的血型不合在临床上比较为少见。目前临床上可根据“三项试验”，即红细胞抗球蛋白试验、抗体放散试验和血清游离抗体试验，并结合临床，综合分析做出诊断。然而新生儿是人生长发育一个特殊阶段，新生儿溶血病虽与新生儿血型密不可分，但其血型抗原位点少，抗原表达弱，抗体水平表达较低，尤其是出生3～4个月时的生理性低γ球蛋白血症，IgG水平仅相当于成人的35%左右，1～3岁时IgG水平也仅为成人的60%，13岁时才基本达到成人水平[8]。鉴于以上原因故血型血清学检测的难度较大，既往通常采用盐水抗球蛋白试验、酶处理红细胞技术等传统方法及手工聚凝胺试验来测定，操作繁琐，时间长，同时需显微镜观察，误差大，主观因素掺杂，不易标准化，且准确率不高[9]。

本院2012年7月-2013年7月采用微柱凝胶卡式法及传统试管法对拟诊的ABO血型不合新生儿溶血病进行平行检测，结果显示微柱凝胶卡式法检出直接抗人球蛋白试验阳性率、抗体游离试验阳性及抗体放散试验阳性率明显高于试管法，临床符合率达99.2%，两法差异有统计学意义，与既往文献[10]报道相符。分析差异原因，与采用的试验方法有关。微柱凝胶卡式法是建立在传统血清学基础上的一项免疫学血型检测技术，是抗原抗体反应、凝胶柱过滤和离心三种技术的集成与结合[11]。原理为当抗原抗体发生反应，红细胞发生凝集，离心时，凝集块不能通过凝胶间隙而留在凝胶上层，呈阳性反应，未凝集细胞离心是可通过凝胶间隙而留在凝胶下层，呈阴性反应。微柱凝胶技术直观、敏感、快速、特异性更好，结果更易于观察。而试管法操作过程中需反复洗涤红细胞，步骤繁琐，受人为因素影响大，结果判断主观化，且试验过程中干扰因素较多，如在放散试验中，试验的温度、酶的pH值，酶化时间等不易把握，容易造成假阳性、假阴性。总之，传统试管法由于时间长、重复性不好等缺点，因此也一直不能被临床广泛推广使用，而微柱法操作过程简单、耗时短、结果易观察，尤其表现在放散试验和游离试验中，易标准化，适宜在临床推广应用。

参考文献

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[9]李娟，方代华，许琴，等.微柱凝胶技术在新生儿同种免疫性溶血病诊断中的临床应用[J].中国实用医刊，2013，40（15）：56-57.

[10]王萍，肖筠，魏红璐.微柱凝胶法和传统试管法在新生儿溶血病诊断中的比较研究[J].中国计划生育学杂志，2012，20（8）：548-549.

[11]马吉联.微柱凝胶技术在新生儿溶血性疾病诊断的研究[J].世界最新医学信息文摘（电子版），2013，13（7）：64-65.

（收稿日期：2014-01-20） （本文编辑：欧丽）endprint

3 讨论

新生儿溶血病是由于母亲体内存在着与胎儿红细胞不合的IgG血型抗体而引起的同种免疫疾病。新生儿溶血病机理是母体的IgG抗体通过胎盘屏障进入胎儿血液中，对胎儿的红细胞进行破坏，造成不同程度的溶血、贫血、黄疸及高胆红素血症等，可引起流产、死胎、死产等，存活的婴儿严重者可导致新生儿严重后遗症如严重贫血、胆红素脑病及智力低下，甚至死亡等[6]。在已知的血型系统中，以ABO血型系统最常见。原因为A、B血型抗原物质广泛存在自然界某些植物、寄生虫及细菌等微生物中，O型血孕妇通常在怀孕前早已接触过A、B血型抗原物质刺激，并可产生相应的不同效价的抗A、抗B的IgG抗体，ABO血型不合50%在第一胎即可发病，因此ABO新生儿溶血病临床多见[7]。其次Rh血型系统，Kell、MN、Duffy等其他系统的血型不合在临床上比较为少见。目前临床上可根据“三项试验”，即红细胞抗球蛋白试验、抗体放散试验和血清游离抗体试验，并结合临床，综合分析做出诊断。然而新生儿是人生长发育一个特殊阶段，新生儿溶血病虽与新生儿血型密不可分，但其血型抗原位点少，抗原表达弱，抗体水平表达较低，尤其是出生3～4个月时的生理性低γ球蛋白血症，IgG水平仅相当于成人的35%左右，1～3岁时IgG水平也仅为成人的60%，13岁时才基本达到成人水平[8]。鉴于以上原因故血型血清学检测的难度较大，既往通常采用盐水抗球蛋白试验、酶处理红细胞技术等传统方法及手工聚凝胺试验来测定，操作繁琐，时间长，同时需显微镜观察，误差大，主观因素掺杂，不易标准化，且准确率不高[9]。

本院2012年7月-2013年7月采用微柱凝胶卡式法及传统试管法对拟诊的ABO血型不合新生儿溶血病进行平行检测，结果显示微柱凝胶卡式法检出直接抗人球蛋白试验阳性率、抗体游离试验阳性及抗体放散试验阳性率明显高于试管法，临床符合率达99.2%，两法差异有统计学意义，与既往文献[10]报道相符。分析差异原因，与采用的试验方法有关。微柱凝胶卡式法是建立在传统血清学基础上的一项免疫学血型检测技术，是抗原抗体反应、凝胶柱过滤和离心三种技术的集成与结合[11]。原理为当抗原抗体发生反应，红细胞发生凝集，离心时，凝集块不能通过凝胶间隙而留在凝胶上层，呈阳性反应，未凝集细胞离心是可通过凝胶间隙而留在凝胶下层，呈阴性反应。微柱凝胶技术直观、敏感、快速、特异性更好，结果更易于观察。而试管法操作过程中需反复洗涤红细胞，步骤繁琐，受人为因素影响大，结果判断主观化，且试验过程中干扰因素较多，如在放散试验中，试验的温度、酶的pH值，酶化时间等不易把握，容易造成假阳性、假阴性。总之，传统试管法由于时间长、重复性不好等缺点，因此也一直不能被临床广泛推广使用，而微柱法操作过程简单、耗时短、结果易观察，尤其表现在放散试验和游离试验中，易标准化，适宜在临床推广应用。

参考文献

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[11]马吉联.微柱凝胶技术在新生儿溶血性疾病诊断的研究[J].世界最新医学信息文摘（电子版），2013，13（7）：64-65.

（收稿日期：2014-01-20） （本文编辑：欧丽）endprint