NDV7793促进人CD4+T细胞表达TRAIL的实验研究

樊晓晖等

【摘要】 目的：研究新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）弱毒株NDV7793能否促进人CD4+ T细胞表达肿瘤坏死因子相关凋亡因子诱导配体（TNF-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL）。方法：首先用免疫磁珠分选法（magnetic activated cell sorting， MACS）分选外周血静止CD4+ T细胞，然后加抗CD3抗体、抗CD28抗体和白细胞介素-2（interleukin-2，IL-2）使之成为能被NDV激活的CD4+ T细胞。用流式细胞技术（flow cytometry，FCM）检测NDV刺激的CD4+ T细胞的TRAIL的表达水平。结果：MACS法分选外周血得到的CD4+ T细胞纯度达到（97.38±0.28）%；能被NDV激活的CD4+ T细胞表面分子CD25和CD69双阳性表达率可达（29.30±1.08）%，与PBS阴性对照组（2.40±1.30）%相比，差异有统计学意义（P<0.05）；FCM检测结果显示，与对照组比较，NDV7793刺激的CD4+ T细胞TRAIL表达水平均有显著升高，且在NDV7793效价为25 HU时达到最大值。结论：NDV7793可刺激CD3抗体、CD28抗体和IL-2预先活化的CD4+ T细胞表达TRAIL。

【关键词】 新城疫病毒； CD4+ T细胞； TNF相关凋亡诱导配体

NDV是经过临床评估后可以作为载体用于溶瘤治疗、基因治疗和免疫激活的五种病毒之一[1-3]。全身治疗时，只有少部分NDV能到达肿瘤组织，其发挥直接的溶瘤作用十分有限[4]。然而NDV在抗肿瘤中却仍能发挥重要作用，这与NDV刺激免疫细胞而发挥抗肿瘤效应有关，这些细胞包括NK细胞、巨噬细胞、树突状细胞以及T细胞等[5-8]。已有实验证明，NDV可刺激NK细胞和巨噬细胞诱导TRAIL的产生而杀伤肿瘤[5-6]。那么CD4+ T细胞是否能在NDV的刺激后上调TRAIL的表达呢？这方面的研究还未见报道。本研究选用来自江西鄱阳湖野鸭的非溶瘤株NDV7793，探讨NDV7793激活人CD4+ T细胞与TRAIL的关系。

1 材料与方法

1.1 材料 新城疫病毒WDKX/7793/2004（简称NDV7793）分离自江西鄱阳湖的野鸭，由香港大学医学院微生物学系管轶教授馈赠；细胞与鸡胚CD4+ T细胞分离自健康人群的外周血（得到捐献者知情同意）。9～10 d SPF鸡胚，购自南宁市良凤江农牧有限公司；淋巴细胞分离液购自挪威AXIS-SHIELD公司；CD4+ T细胞分选试剂盒（130-091-155）购自Miltenyi公司；PE标记的鼠抗人CD25（anti-CD25-PE）单克隆抗体、FITC标记的鼠抗人CD69（anti-CD69-FITC）单克隆抗体、PE标记的鼠抗人TRAIL（anti-TRAIL-PE）单克隆抗体、PE标记的Mouse IgG1 κ同型对照、FITC标记的Mouse IgG1 κ同型对照、鼠抗人CD3（anti-CD3）单克隆抗体、鼠抗人CD28（anti-CD28）单克隆抗体均购自eBioscience公司；FITC标记的鼠抗人CD4（anti-CD4-FITC）单克隆抗体购自BD公司；重组人IL-2、重组人IFNα均购自PEPROTECH公司；RNeasy Mini总RNA提取试剂盒购自QIAGEN公司；流式细胞仪（BDFACSCalibur）为美国BD公司产品。

1.2 方法

1.2.1 NDV7793的扩增与纯化 取0.2 mL血凝效价为51.2 HU（hemagglutinationuint，血凝单位）的NDV7793接种于9～10日龄的SPF鸡胚中。扩增培养48 h后，收取血凝效价≥1：1024的尿囊液，置4 ℃备用。4 ℃离心（1000×g，30 min）初步纯化，取上清液于4 ℃超速离心（50000×g，1 h），去上清。用含0.1%EDTA的PBS溶解病毒沉淀，得NDV7793病毒原液，效价51200 HU。将病毒原液用含0.1%EDTA的PBS 10倍稀释成5120 HU的病毒工作液，置-80 ℃保存，备用。

1.2.2 CD4+ T细胞的分离纯化及鉴定 抽取健康志愿者的静脉血，用肝素钠抗凝，与生理盐水等体积稀释后采用Ficoll密度梯度离心法离心（800×g，离心20 min），以获取外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC），之后用生理盐水充分洗涤所得PBMC并计数。采用免疫磁珠分选法（阴选法）从PBMC悬液中分选收集CD4+ T细胞。所得CD4+ T细胞在2 h内以anti-CD4-FITC抗体染色，同时设立IgG同型对照组和空白对照组，经FCM鉴定后，以CD4+ T细胞的比例为90%～99%作为合格纯度。

1.2.3 CD4+ T细胞的预先活化及活化水平的检测 取无菌96孔平底板，每孔加入50 μL（10 μg/mL）的anti-CD3抗体进行包被，4 ℃孵育过夜，弃去anti-CD3包被液，用200 μL PBS洗涤两次，每孔加入2×105个CD4+ T细胞，再依次加入anti-CD28和IL-2（终浓度分别为2 μg/mL和200 U/mL），作用16 h后，将5×105个anti-CD3、anti-CD28和IL-2活化后的CD4+ T细胞重悬于PBS中，加入anti-CD69-FITC和anti-CD25-PE抗体进行染色，2 h内采用FCM法检测CD4+ T细胞的活化水平。

1.2.4 FCM检测不同效价NDV7793刺激anti-CD3、anti-CD28和IL-2活化的CD4+ T细胞16h后对TRAIL蛋白表达的影响 采用效价分别为25、50、100、200 HU的NDV7793刺激活化的CD4+ T细胞16 h。设立四组对照组：阴性对照组（PBS）、IFNα阳性对照组（IFNα，200 U/mL）、25 HU经紫外线灭活的NDV7793（ultra-violet inactivated NDV7793，UV-NDV7793 ）刺激组和25 HU NDV刺激的未活化的CD4+ T细胞组。收集各组CD4+ T细胞，加入5 μL anti-TRAIL-PE抗体染色（同时设立IgG同型对照组和空白对照组），4 ℃孵育30 min，加入PBS，200×g离心10 min，洗涤细胞两次，加入300 μL PBS重悬细胞，FCM检测CD4+ T细胞表面TRAIL蛋白的表达情况。

1.3 统计学处理 采用SPSS 13.0统计学软件对数据进行处理，计量数据以（x±s）表示，进行随机区组设计方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CD4+ T细胞纯度的鉴定 FCM法检测结果显示，经过免疫磁珠分选法分选出的CD4+ T细胞的纯度达到（97.38±0.28）%。

2.2 anti-CD3、anti-CD28和IL-2活化CD4+ T细胞的结果 CD4+ T细胞经anti-CD3、anti-CD28和IL-2活化后，FCM检测CD4+ T细胞的活化程度，即CD25和CD69在CD4+ T细胞膜上表达率。结果如图1所示，活化的CD4+ T细胞的CD25和CD69的双阳性表达率可达（29.30±1.08）%，远高于PBS阴性对照组的（2.40±1.30）%，差异有统计学意义（P<0.01），见图1。

2.3 NDV7793刺激anti-CD3、anti-CD28和IL-2活化后的CD4+ T细胞后对CD4+ T细胞中TRAIL蛋白表达水平的影响 采用不同效价的NDV7793刺激anti-CD3、anti-CD28和IL-2活化的CD4+ T细胞16 h后，FCM检测TRAIL蛋白的表达情况，结果显示不同效价NDV（25、50、100 HU和200 HU）刺激后的TRAIL蛋白的表达量分别为（26.59±5.79）%、（22.94±3.23）%、（18.76±2.85）%和（19.56±4.51）%，与PBS阴性对照组的（5.82±2.05）%和未活化组（4.28±1.42）%比较，差异有统计学意义（P<0.01）。其中25 HU NDV7793刺激组与IFNα阳性对照组（21.36±1.60）%比较，差异也有统计学意义（P<0.05）。UV-NDV刺激组的TRAIL蛋白表达率为（14.08±2.62）%，与PBS组比较差异有统计学意义（P<0.01）。25 HU NDV7793刺激组与UV-NDV刺激组比较，差异有统计学意义（P<0.01），同时与100、200 HU NDV7793刺激组比较，差异也有统计学意义（P<0.05），从而可知，25 HU NDV7793刺激活化的CD4+ T细胞TRAIL蛋白表达量最高（图2）。

3 讨论

T细胞是人体重要的免疫细胞之一。根据其表面的白细胞分化抗原的不同，又可以分为CD4+ T细胞、CD8+ T细胞等亚群。根据T淋巴细胞的功能可将其分为细胞毒性T细胞（cytotoxic T cell，CTL）、辅助性T细胞（helper T cell）、调节/抑制T细胞（regulatory/suppressor T cell）和记忆T细胞（memory T cell）。长期以来，在抗肿瘤细胞免疫中，人们一直把重点放在CD8+ T CTL上，而忽视了CD4+ T CTL和CD4+ Th细胞的作用。已有研究表明活化的CD4+ CTL细胞可直接杀伤肿瘤细胞[9]，然而NDV通过对CD4+ T细胞的免疫刺激进而发挥抗肿瘤效应的研究较少报道，因此，笔者选择用NDV7793弱毒株刺激CD4+ T细胞，探讨CD4+ T细胞活化的初步机制，为后续研究NDV7793活化CD4+ T细胞对癌细胞的杀伤及机制研究奠定基础。

关于活化CD4+ T细胞的表型，笔者选择了TRAIL。TRAIL是继TNF、FasL之后发现的第3个TNF家族的凋亡因子，在大多数的正常组织细胞都有显著表达，但并不杀伤大多数的正常细胞，其首要的作用是介导肿瘤细胞的凋亡。在肿瘤生物治疗中，TRAIL作为肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）超家族成员之一，已经成非常有潜力的肿瘤生物治疗因子之一[10-11]。

实验中笔者用流式细胞术（FMC）检测到了受NDV7793刺激的活化的CD4+ T细胞显著表达了TRAIL蛋白，与IFNα阳性对照组及PBS为阴性对照组相比，差异具有统计学意义（P<0.05），证实了NDV7793可以上调活化的CD4+ T细胞TRAIL的表达。NDV7793在刺激未活化的CD4+ T时，TRAIL蛋白并没有得到显著表达，在此笔者推测NDV7793不能激活CD4+ T细胞，并且只能通过活化后的CD4+ T发挥抗肿瘤效应。另外，被灭活的NDV7793（UV-NDV）在刺激活化的CD4+ T时，TRAIL蛋白的表达高于PBS阴性对照组，却低于IFNα阳性对照组和未被灭活的NDV7793组（图2），说明TRAIL的上调过程可能存在多个途径，需要进行进一步研究。

在NDV刺激CD4+ T细胞分泌TRAIL蛋白的实验中，笔者还发现，NDV刺激CD4+ T细胞分泌TRAIL，随着NDV效价的增高到一定的浓度（25 HU），CD4+ T细胞分泌TRAIL反而下降（图2），可能的原因是25 HU的NDV是刺激CD4+ T细胞表达TRAIL的合适浓度，当提高NDV浓度后，过多的NDV将通过抑制CD4+ T细胞表达TRAIL过程的某个机制而下调TRAIL的表达，NDV与CD4+ T细胞表达TRAIL这种负相关的详细机制，值得去深入探讨。

综上，笔者证实了NDV7793刺激活化的CD4+ T细胞后，上调了TRAIL蛋白的表达，为进一步完善NDV通过TRAIL发挥抗肿瘤效应的免疫机制奠定基础，也为NDV应用于抗肿瘤的免疫治疗提供一些基础研究的实验线索。

参考文献

[1] Aghi M，Martuza R L.Oncolytic viral therapies - the clinical experience[J].Oncogene，2005，24（52）：7802-7816.

[2] Chlichlia K，Schirrmacher V，Sandaltzopoulos R.Cancer immunotherapy： battling tumors with gene vaccines[J].Current Medicinal Chemistry Anti-IFNlammatory and Anti-allergy Agents， 2005，4（4）：353-356.

[3] Schirrmacher V.T cell-mediated immunotherapy of metastases： state of the art in 2005[J].Expert Opin Biol Ther，2005，5（8）：1051-1068.

[4] Schirrmacher V，Griesbach A，Ahlert T.Antitumor effects of newcastle disease virus in vivo： local versus systemic effects[J].Int J Oncol，2001，18（5）：945-952.

[5]殷君，王立芳，樊晓晖，等.新城疫病毒对人NK细胞表达TRAIL的促进作用[J].肿瘤，2012，32（12）：974-981.

[6] Wilden H，Schirrmacher V，Fournier P.Important role of interferon regulatory factor （IRF） -3 in the interferon response of mouse macrophages upon IFNection by Newcastle disease virus[J].Int J Oncol，2011，39（2）：493-504.

[7] Fournier P，Arnold A，Schirrmacher V.Polarization of human monocyte-derived dendritic cells to DC1 by in vitro stimulation with Newcastle Disease Virus[J].J Buon，2009，14（1）：11-22.

[8] Fournier P，Schirrmacher V.Bispecific antibodies and trispecific immunocytokines for targeting the immune system against cancer： preparing for the future[J].Bio Drugs，2013，27（1）：35-53.

[9] Brown D M.Cytolytic CD4 cells： direct mediators in infectious disease and malignancy[J].Cell Immunol，2010，262（2）：89-95.

[10] Ashkenazi A，Pai R C，Fong S，et al.Safety and antitumor activity of recombinant soluble Apo2 ligand[J].The Journal of clinical investigation，1999，104（2）：155-162.

[11]郝景波，王文飞，吴云舟，等.重组新城疫病毒Anhinga株与TRAIL蛋白协同杀伤肿瘤细胞[J].中国生物化学分子生物学报，2011，27（1）：32-39.

（收稿日期：2014-02-19） （本文编辑：蔡元元）

[3] Schirrmacher V.T cell-mediated immunotherapy of metastases： state of the art in 2005[J].Expert Opin Biol Ther，2005，5（8）：1051-1068.

[4] Schirrmacher V，Griesbach A，Ahlert T.Antitumor effects of newcastle disease virus in vivo： local versus systemic effects[J].Int J Oncol，2001，18（5）：945-952.

[5]殷君，王立芳，樊晓晖，等.新城疫病毒对人NK细胞表达TRAIL的促进作用[J].肿瘤，2012，32（12）：974-981.

[6] Wilden H，Schirrmacher V，Fournier P.Important role of interferon regulatory factor （IRF） -3 in the interferon response of mouse macrophages upon IFNection by Newcastle disease virus[J].Int J Oncol，2011，39（2）：493-504.

[7] Fournier P，Arnold A，Schirrmacher V.Polarization of human monocyte-derived dendritic cells to DC1 by in vitro stimulation with Newcastle Disease Virus[J].J Buon，2009，14（1）：11-22.

[8] Fournier P，Schirrmacher V.Bispecific antibodies and trispecific immunocytokines for targeting the immune system against cancer： preparing for the future[J].Bio Drugs，2013，27（1）：35-53.

[9] Brown D M.Cytolytic CD4 cells： direct mediators in infectious disease and malignancy[J].Cell Immunol，2010，262（2）：89-95.

[10] Ashkenazi A，Pai R C，Fong S，et al.Safety and antitumor activity of recombinant soluble Apo2 ligand[J].The Journal of clinical investigation，1999，104（2）：155-162.

[11]郝景波，王文飞，吴云舟，等.重组新城疫病毒Anhinga株与TRAIL蛋白协同杀伤肿瘤细胞[J].中国生物化学分子生物学报，2011，27（1）：32-39.

（收稿日期：2014-02-19） （本文编辑：蔡元元）

[3] Schirrmacher V.T cell-mediated immunotherapy of metastases： state of the art in 2005[J].Expert Opin Biol Ther，2005，5（8）：1051-1068.

[4] Schirrmacher V，Griesbach A，Ahlert T.Antitumor effects of newcastle disease virus in vivo： local versus systemic effects[J].Int J Oncol，2001，18（5）：945-952.

[5]殷君，王立芳，樊晓晖，等.新城疫病毒对人NK细胞表达TRAIL的促进作用[J].肿瘤，2012，32（12）：974-981.

[6] Wilden H，Schirrmacher V，Fournier P.Important role of interferon regulatory factor （IRF） -3 in the interferon response of mouse macrophages upon IFNection by Newcastle disease virus[J].Int J Oncol，2011，39（2）：493-504.

[7] Fournier P，Arnold A，Schirrmacher V.Polarization of human monocyte-derived dendritic cells to DC1 by in vitro stimulation with Newcastle Disease Virus[J].J Buon，2009，14（1）：11-22.

[8] Fournier P，Schirrmacher V.Bispecific antibodies and trispecific immunocytokines for targeting the immune system against cancer： preparing for the future[J].Bio Drugs，2013，27（1）：35-53.

[9] Brown D M.Cytolytic CD4 cells： direct mediators in infectious disease and malignancy[J].Cell Immunol，2010，262（2）：89-95.

[10] Ashkenazi A，Pai R C，Fong S，et al.Safety and antitumor activity of recombinant soluble Apo2 ligand[J].The Journal of clinical investigation，1999，104（2）：155-162.

[11]郝景波，王文飞，吴云舟，等.重组新城疫病毒Anhinga株与TRAIL蛋白协同杀伤肿瘤细胞[J].中国生物化学分子生物学报，2011，27（1）：32-39.

（收稿日期：2014-02-19） （本文编辑：蔡元元）