凝胶注入系统在DNA分型中的影响分析及解决方法

2014-04-24常海龙公安部第一研究所

警察技术 2014年6期

常海龙公安部第一研究所

一、引言

DNA分型自20世纪80年代中期问世以来，在法医学领域引发了革命性的变革，极大提高了执法部门根据现场搜寻罪犯的能力。DNA分型就是通过对遗传物质DNA序列多态性及长度多态性的检验来进行法医学的个体识别及亲权鉴定。如今，该技术已经成为法医物证检验的常规技术，为打击违法犯罪提供了强有力的武器。

毛细管凝胶电泳是目前应用最为广泛、技术最为成熟的主流DNA分型技术，被全世界范围内的法医学DNA实验室广泛采用。毛细管凝胶电泳向毛细管柱中充入凝胶聚合物等筛分介质，通过建立高压直流电场驱动带负电的DNA片段，通过筛分介质，对DNA片段按其大小进行筛分分离。

公安部第一研究所在国家十一五课题“法医DNA专用检测硬件平台关键技术研究”的支撑下，成功研制了基于毛细管凝胶电泳的GA118-16A遗传分析仪，其中凝胶注入系统是具有自主知识产权的关键核心部件。本文对凝胶注入系统工作原理及对DNA分型结果影响要素进行分析，结合在凝胶注入系统研制过程及产业化过程中遇到的常见问题，提出解决方法，期待对公安系统广大法医工作者有所帮助，以更好应用遗传分析仪，为打击违法犯罪提供更加高效的手段。

二、DNA分型原理及常用筛分介质

理想的DNA分离介质应具备以下几种性质：（1）高亲水性，（2）良好的溶解能力，（3）良好的筛分性能，（4）在碱性条件下仍具有很好的化学稳定性，（5）具有动态涂层能力以抑制电渗流及消除DNA和毛细管管壁的吸附作用。

毛细管凝胶电泳最常采用聚二甲基丙烯酰胺POP-4和POP-7聚合物用于DNA分型。聚二甲基丙烯酰胺有一定的网状结构，是由聚丙烯酰胺和交联共聚单体N，N’-甲叉双丙烯酰胺在TEMED催化下聚合交联形成的，其孔径与链长度和交联度有关。

聚二甲基丙烯酰胺的优点是吸附很小，能够有效消除毛细管电渗现象；减小分子扩散，抗对流；具有分子筛效应，迁移时间能反映组分分子量大小；在一定温度范围内透明，便于观察和实现样品的光学检测。但其制备复杂、产生气泡会中断电路，一些大分子积留会影响毛细管柱的寿命，影响聚合物的动态涂层能力和降低聚合物的黏度。

三、凝胶注入系统的组成及工作原理

要实现毛细管电泳的DNA分型，首先必须将聚二甲基丙烯酰胺等筛分介质注入内径仅为50μm的毛细管，这需要系统提供很高的压强，凝胶注入系统正是为实现这一功能而设计的。该系统由精密分配泵、针阀系统、下胶块、凝胶瓶、高压电极、毛细管等组成，系统工作介质为聚二甲基丙烯酰胺凝胶。精密分配泵提供动力源，将凝胶瓶中的凝胶吸入泵仓。凝胶瓶管路末端接上单向阀，当精密分配泵的柱塞向下运动时，单向阀关闭。若此时针阀系统打开，即下胶块管路开通，由于毛细管的流体阻力远大于下胶块管路，凝胶将向下胶块管路流动，在排除气泡过程中经常应用此操作。当针阀系统关闭时，即下胶块管路闭合，凝胶将向毛细管中运动，向毛细管中注入凝胶，从而实现毛细管的自动注胶功能。该系统组成参见图2。

该系统具有气泡排除功能。由于凝胶自身混有一定的气泡，同时在更换凝胶的过程中，不可避免的会带入气泡。气泡的存在将阻断电泳通路或使通路不稳定。因此，当凝胶注入系统中有气泡时，必须运行该系统的排气泡操作，确保注入毛细管中的凝胶没有气泡。

为实现凝胶注入和排除气泡操作，凝胶注入系统在下胶块位置设计了针阀系统，这个子系统由电磁铁、针阀销、针阀构成，其组成见图3。当需要闭合针阀系统时，电磁铁关闭，电磁铁带动针阀销转动，使针阀向下运动，与下胶块的锥形孔形成紧密配合。为了缓冲电磁铁闭合时针阀对下胶块的冲击，在电磁铁与针阀销之间设置了一个弹簧及调节螺钉，当电磁铁闭合时，弹簧起到一定的缓冲作用，并为针阀与下胶块的闭合提供密封压强。

四、DNA分型中凝胶注入系统的影响分析及解决方法

作为基于毛细管电泳的DNA检测仪的重要组成部分，凝胶注入系统的工作状态直接影响到DNA的检测结果。以下是DNA检测过程中遇到的相关问题及解决方法：

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（一）凝胶注入系统气泡排除问题及解决方法

凝胶注入系统一个重要的功能就是将电泳通道中凝胶的气泡排除。气泡会阻断电泳通路或改变电泳迁移率，导致严重的区带扩展，降低分辨力，影响DNA检测结果。如果气泡进入毛细管中，直流高压电场被切断，电泳无法形成，不能通过筛分作用对DNA片段进行分离；如果气泡进入集束端安装位置或下胶块管路中，会导致电泳通道变窄，电阻变大，电泳通道发热，这将导致胶的黏度等性质发生变化，从而改变DNA片段在电泳过程中的迁移率，影响分离效果，严重时会损坏集束端和下胶块管路。

气泡常出现的位置有三种情况：

1．凝胶瓶管路出现气泡

在更换凝胶瓶的过程中可能会引入新的气泡，气泡位于凝胶瓶管路中，此时应运行自动排气泡程序排出气泡。因此，在更换凝胶瓶之前，应该将待用凝胶常温静置2小时以上，以使凝胶中的气泡析出；同时在更换凝胶瓶的过程中避免剧烈操作，防止凝胶瓶管路中混入气泡。

2．毛细管集束端出现气泡

当毛细管集束端位置纺锤体密封不严时，在集束端容易出现气泡。毛细管集束端出现气泡会导致高压电泳通道电阻增大，气泡位置发热，从而影响DNA片段的迁移率，同时容易损坏集束端。此时应该拧松手轮，运行精密分配泵，使精密分配泵柱塞向下运动，使气泡随凝胶从集束端排除。由于凝胶具有生物毒性，操作中应佩戴手套操作，并使用滴水盘收集排除的凝胶。

3．下胶块管路出现气泡

当阳极杯中的缓冲液没有达到指定体积（即达到刻度线）时，由于下胶块管路处于开放状态，在温度变化的时候气泡容易进入下胶块管路。此处气泡会导致下胶块管路局部发热，从而影响DNA片段的迁移率，同时容易损坏下胶块管路。此时应该运行精密分配泵，使精密分配泵柱塞向下运动，使气泡随凝胶从下胶块排除。

（二）凝胶注入系统凝胶无法注入问题及解决方法

凝胶注入系统的主要功能是向毛细管中注入凝胶，在遗传分析仪的使用过程中，由于各种因素的影响，会使凝胶注入系统无法正常工作。如果仪器继续运行，毛细管内残留的废胶会导致毛细管电泳过程中出现杂峰；同时会使DNA片段的迁移率变低，峰值变宽，DNA检测过程无法正常完成。相关的问题原因及解决办法如下：

1．如果凝胶瓶管路出现凝胶回流现象，则是单向阀出现故障

在发现凝胶注入系统出现无法注入凝胶的情况，首先应该检查凝胶瓶管路是否出现凝胶回流现象，如果出现，说明单向阀无法实现单向密封作用。单向阀内部是由一个红宝石球和蓝宝石座组成的精密单向密封装置，在长期不使用凝胶注入系统的时候，红宝石球和蓝宝石座由于凝胶干结附着在密封件表面，从而使单向阀失去单向密封能力。此时应取下单向阀，用超纯水润洗单向阀，清洗完毕后，再重新吸入凝胶，完成凝胶注入工作。

2．如果水洗密封舱出现凝胶，说明高压密封圈损坏

精密分配泵的高压实现是由蓝宝石柱塞和高压密封圈配合实现，由于长时间工作，或者由于凝胶注入系统长期不工作导致凝胶干结在柱塞表面，在柱塞运动过程中可能会损坏高压密封圈，使蓝宝石柱塞与高压密封圈之间出现泄漏，凝胶将从此位置泄漏到水洗密封舱内。此时，应该立即停止精密分配泵的操作，更换高压密封圈。

3．如果下胶块管路接头处出现凝胶，说明下胶块管路接头密封不严

下胶块管路接头是凝胶注入系统实现高压的一个关键部件，采用锥形密封头配合精密分配泵及下胶块实现密封，如果固定螺母没足够预压力，就会出现凝胶泄漏现象。此时应加大密封接头固定螺母的拧紧力度，使其达到密封效果。

4．如果在毛细管集束端出现凝胶泄漏，说明毛细管集束端密封不严

毛细管集束端是与锥形纺锤体与手轮的配合实现密封，手轮依靠螺纹实现预紧力，纺锤体的两端锥形面与精密分配泵和手轮密封面的配合实现高压密封。此时，首先应拧紧手轮，加大手轮的预紧力，以提高密封面的压力；如果加大预紧力后仍然出现凝胶泄漏现象，则是纺锤体表面有残留杂质，应取出纺锤体及手轮，超纯水润洗后，重新安装毛细管集束端。

5．如果从阳极杯观察到下胶块有凝胶流出，说明下胶块针阀密封不严

下胶块针阀密封是依靠针阀的锥形面与下胶块配合实现高压密封，常见的泄漏情况有两种：（1）由于磨损导致针阀压力不够。针阀和下胶块均采用塑料制成，在长期开合过程中难免有一定的磨损，此时针阀与下胶块的配合间隙加大，容易出现凝胶泄漏现象。遇到这种情况，应该调节电磁铁调节螺钉，增加电磁铁与针阀销之间弹簧的弹力，从而加大针阀与下胶块配合的压力，实现高压密封。（2）下胶块或针阀损坏。在磨损进一步加大的情况下，由于下胶块或者针阀磨损不规则性导致密封面无法紧密配合，此时加大弹簧弹力也无法实现高压密封，应更换下胶块或者针阀。

6．大分子堵塞毛细管导致凝胶注入压力过大

在毛细管长期使用过程中，一些大分子会残留在毛细管内壁，随着时间的推移，积累越来越多，最终导致精密分配泵的压力不足以将适量的凝胶注入到毛细管中。这种情况需要更换新的毛细管，再进行凝胶注入。