大围山森林土壤中高产纤维素酶菌株的筛选及鉴定

李 悦，李世俊，薛桥丽，胡永金*

（1.云南农业大学 食品科学技术学院，云南 昆明 650201；2.云南农业大学 图书馆，云南 昆明650201）

随着人口膨胀和全球经济的迅猛发展，人类对于能源的需求也呈现逐年增长的趋势，能源短缺问题日益严重，并且全世界每年产生大量的农业废弃纤维素资源没有得到充分利用，造成极大浪费和环境污染[1-3]，这为开发和利用纤维素提供了无穷的可再生资源。其次近年来对纤维素降解方面的研究最经济、环保的方法就是生物降解[4]，所以寻找和开发高产纤维素酶菌种，是开发利用纤维素资源的前提和关键[5-6]。因此，从环境中筛选酶活高的野生菌株有着重要的意义[7-8]。

实验以大围山原始森林土壤为材料，通过初筛（刚果红纤维素水解试验和滤纸条分解试验）和复筛（利用3,5-二硝基水杨酸法测定内切纤维素酶活，滤纸酶活和β-葡萄糖苷酶活），筛选出了一株具有较强纤维素酶分解能力的菌株，期望能有效回收利用纤维素废弃物，提高其附加价值，以适应纤维素酶和纤维素乙醇工业化生产的需求。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 实验材料

土壤样品：云南省红河州屏边苗族自治县大围山原始森林腐烂落叶下面土壤。

1.1.2 主要试剂

羧甲基纤维素钠（sodium carboxyl methyl cellulose，CMC-Na，分析纯）、3,5-二硝基水杨酸（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；水杨苷（≥99%）：上海源叶生物科技有限公司；刚果红（分析纯）：天津博迪化工股份有限公司；酒石酸钾钠（分析纯）：天津市永大化学试剂有限公司；琼脂粉：广东环凯微生物科技有限公司；定量滤纸（中速）：杭州富阳特种纸业有限公司。

1.1.3 培养基

种子培养基采用马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）培养基：土豆200 g，去皮，切成小块，煮沸30 min，纱布过滤，定容至1 L，再加2%葡萄糖，1.5%琼脂，自然pH，121 ℃灭菌30 min。

CMC-Na培养基：CMC-Na 1.5%，NH4NO30.1%，酵母膏0.1%，MgSO4·7H2O 0.05%，KH2PO40.1%，琼脂2%，pH自然，121 ℃灭菌30 min。

刚果红纤维素琼脂培养基：CMC-Na 1.5%，NH4NO30.1%，KH2PO40.1%，MgSO4·7H2O 0.05%，琼脂2%，pH自然，121 ℃灭菌30 min。培养4 d之后用刚果红染色进行鉴定。

滤纸液体培养基[9]：滤纸2%，酵母膏0.4%，NH4NO30.4%，MgSO4·7H2O 0.02%，KH2PO40.4%，pH自然，121 ℃灭菌30 min。

液体产酶培养基[9]：CMC-Na l%，蛋白胨0.3%，酵母膏0.02%，（NH4）2SO40.2%，KH2PO40.4%，CaC12·2H2O 0.03%，MgSO4·7H2O 0.03%，pH自然，121 ℃灭菌30 min。

1.2 仪器与设备

HX121-0054立式压力蒸汽灭菌锅：上海华线医用核子仪器有限公司；SHA-BA恒温振荡器：常州澳华仪器有限公司；101-2A电热鼓风干燥箱：北京中兴伟业仪器有限公司；SW-CJ-2D超净工作台：苏州净化设备有限公司；7200型可见分光光度计：尤尼柯（上海）仪器有限公司；DT5-2型低速台式离心机：北京时代北利离心机有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 样品的处理

将从菌源地采样得来的样品分别溶于无菌水中，稀释成一系列不同的稀释度，取10-3、10-4、10-53种稀释度，涂布于CMC-Na培养基，每个稀释度涂布3个平板，培养。反复划线分离至单个菌落。

1.3.2 初筛[10-11]

（1）将分离得到的单菌落接种于刚果红纤维素琼脂平板上，28 ℃恒温箱中培养4 d后用1 mg/mL的刚果红溶液染色30 min，再用蒸馏水清洗，最后用1 mo1/L的NaCl溶液脱色30 min。以透明圈的直径和菌落直径的比值大小作为筛选的标准，挑选出该比值较大的菌再进行划线分离，镜检确定菌体为单菌落后，接种于保藏培养基上保存。

（2）将滤纸条培养基的液体部分装入250 mL三角瓶中，每个100 mL，再加入2张灭过菌的滤纸条（滤纸经烘干后称质量），将保存的菌种制成菌悬液，分别接种于滤纸条培养基，于28 ℃恒温培养，于第7天采用失重法测定滤纸溃解情况，重复3次，测定反应体系中滤纸失重率，挑选出失重率较高的菌再去进行复筛。失重率计算公式如下：

式中：x为失重率，%；m为接种前滤纸条干质量，g；m1为接种培养后滤纸条干质量，g。

1.3.3 复筛[9，12-13]

通过初筛得到的菌株分别接种到CMC-Na液体种子培养基中于28 ℃、120 r/min培养3 d获得均匀的种子，然后按一定比例分别接种到液体产酶培养基中于28 ℃、120 r/min培养6d后离心获得粗酶，以3,5-二硝基水杨酸（dinitrosalicylic acid，DNS）法测定羧甲基纤维素酶活（carboxyl methyl cellulose activity，CMCA)，滤纸酶活（filter paper activity，FPA)和β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase）酶活。

粗酶液制备：将发酵液5 000 r/min离心10 min，取上清液作为粗酶液。酶活单位采用国际定义方法：以1 mL酶液在1 min内分解底物生成1 μg葡萄糖的酶量定义为1个酶活单位（U）。

（1）葡萄糖标准溶液的配制：分别加入0、0.2mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL葡萄糖标准液（1 mg/mL），加入3 mL配制好的DNS试剂混合均匀，在沸水浴中加热10 min，取出后立即用冷水冷却到室温，每管稀释到15 mL，摇匀。在波长540 nm处测定OD值并记录结果，以葡萄糖含量为横坐标，以对应的OD值为纵坐标，作标准曲线。

（2）羧甲基纤维素酶活力（CMCA）测定：分别向4支管中（1支空白管，3支样品管），加入用pH值为5.0醋酸-醋酸钠缓冲溶液配制的CMC-Na溶液2.00 mL，然后加入一定稀释比例的酶液0.50 mL（空白管不加），混匀。将4支试管置于（50±0.1）℃水浴中反应30 min，迅速向各管加入DNS试剂3.0 mL，再于空白管中加入稀释好的酶液0.5 mL。将4支管同时放入沸水浴中，加热10 min取出。冷却至室温，定容至15 mL，摇匀，以空白管（对照液）调零，在波长540 nm条件下测OD值。

（3）滤纸酶活力（FPA）的测定：分别向4支管中（1支空白管，3支样品管），加入（50±0.5）mg滤纸和pH值为5.0的醋酸-醋酸钠缓冲溶液1.5 mL，然后加入一定稀释比例的酶液0.50 mL（空白管不加），使管内溶液浸没滤纸，盖塞。将4支试管同时置于（50±0.1）℃水浴中反应60 min。立即向各管加入DNS试剂3.0 mL。再于空白管中加入稀释好的酶液0.50 mL。后续操作同上。

（4）β-葡萄糖苷酶酶活的测定：取0.5 mL适当倍数稀释的酶液，加入0.5 mL 1.0%的水杨苷溶液，55 ℃保温20 min后，加入3 mL DNS试剂，充分混合在沸水中煮沸5 min，冷却后，定容至15 mL，摇匀。在波长540 nm处测OD值，另取一支试管加入灭活的酶液作为对照。

1.3.4 菌株鉴定

（1）形态学特征初步鉴定[14-15]

将菌株接种到PDA平板上培养7 d后观察菌落的特征，在平板上挑菌体少许，涂于载玻片上，置于显微镜下观察。

（2）分子生物学鉴定

将目的菌送于华大基因科技公司测序，进行18S rRNA基因序列比对分析。

2 结果与分析

2.1 葡萄糖标准曲线

以葡萄糖质量浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线，结果见图1，回归系数R2=0.999 7，线性关系良好。

图1 葡萄糖标准曲线Fig.1 Standard curve of glucose

2.2 初筛

将样品处理所得196株单菌落点种于刚果红纤维素琼脂平板上进行初筛，以培养4 d后透明圈直径和菌落直径比值≥2.0作为筛选的标准，满足条件的菌株有20株，实验结果见表1，平板上生长的菌株经刚果红染色后结果如图2所示，同时将这20株菌株接种到滤纸条培养基中，测定滤纸失重率，结果见表2。

表1 刚果红平板水解圈筛选结果Table 1 Screening results of hydrolyzed circle by Congo red plate

图2 霉菌在刚果红平板上染色后结果Fig.2 Result of moulds after dying in Congo red plate

表2 滤纸失重率结果Table 2 Results of filter paper weight loss ratio

根据表2结果，以滤纸失重率＞15%为标准，筛选出的菌株作为下步复筛的目的菌株，分别是3-2、5-3、11-1、16-7。

2.3 复筛

将初筛出来的4株菌制成菌悬液，按2%的接种量接种到CMC-Na液体发酵培养基中，在28 ℃，120 r/min的条件下，培养6 d后测定不同的酶组分活力，结果见表3。

表3 不同菌种产酶能力的比较Table 3 Enzyme production capacity comparison of different strains

由表3可知，经酶活测定，菌株16-7的各个酶活最大。相对另外的3株菌而言，无论是透明圈直径与菌落直径比值，滤纸失重率，还是各个酶活值相较之都有优势，因此选择16-7号菌作为目的菌进行后续实验。

2.4 菌株鉴定

2.4.1 形态鉴定

（1）菌落形态观察：菌株16-7在PDA平板上培养7 d后，菌落颜色为灰绿色，菌丝质地呈地毯状（半绒毛状），背面呈灰色，无渗出液，周边以白色絮状扩散，呈同心圆状，菌落形态见图3。

（2）显微镜观察：营养菌丝具有横隔，子实体为扫帚状，表面产生许多小梗，小梗上着生成串的球状或圆形分生孢子，单个孢子较光滑，见图4。

依据菌落形态和显微镜观察，结合真菌鉴定手册：初步鉴定为半知菌亚门，丝孢纲，丝孢目，丛梗孢科，青霉属（Penicillium）。

图3 16-7菌落形态Fig.3 Colonial morphology of strain 16-7

图4 16-7显微镜下菌株形态特征Fig.4 Morphological characteristics of strain 16-7 under microscope

2.4.2 分子生物学鉴定[16]

将测得的有效序列提交GenBank数据库，进行Blasten检索。分析结果表明，菌株16-7的18S rRNA基因序列与小刺青霉（Penicillium spinulosum）的18S rRNA基因序列同源性高达99%，初步确定该真菌为小刺青霉。16-7的18S rDNA序列长度为452 bp，全序列如下：

GCCGGGGGGCTTCTGCCCCCGGGTCCGCG CGCACC GGAGACACCATTGAACTCTGTCTGAAGATTGCAGT CTGAGCATAAACTAAATAAGTTAAAACTTTCAACA ACGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGC AGCGAAATGCGATAACTAATGTGAATTGCAGAATT CAGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCACATTGCGC CCCCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCG TCATTGCTGCCCTCAAGCACGGCTTGTGTGTTGGGC TCCGTCCCCCCGGGGACGGGTCCGAAAGGCAGCGG GCGGCACCGAGTCCGGTCCTCGAGCGTATGGGGCT TTGTCACCCGCTCTGTAGGCCCGGCCGGCGCCAGCC GACAACCAATCATCCTTTTCAGGTTGACCTCGGATC AGGTAGGGATACCGCTGAACTTAAGCATA

3 结论

实验结果表明，利用刚果红纤维素水解及滤纸条分解初筛，液体产酶复筛的方法筛选高产纤维素酶菌株是可行的，将多种方法综合应用可得到更为准确可靠的实验结果。刚果红纤维素平板透明圈筛选法明显优于传统的筛选法，该法除了可用于识别产纤维素酶的菌株外，还可根据透明圈大小、透明圈出现早晚，粗略估计每株菌产酶能力，大幅度减少了筛选工作量。同时考虑滤纸是天然结晶类纤维素，且滤纸酶活力是纤维素酶组分的重要组成，因此可以通过观察滤纸培养基中滤纸分解程度进行二次初筛。最后对CMC酶活，滤纸酶活和β-葡萄糖苷酶活进行测定，综合反映了3类酶组分的协同作用，更加真实准确地反映了纤维素酶的活力。本研究对目的菌进行形态学观察和分子生物学鉴定（18S rRNA基因序列分析）相结合的方法，能够快速、准确地对微生物种属进行鉴定。

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