桦黄多糖提取工艺及抗氧化性研究

张丽华，刘 盼，赵 鹏 *，杜永鹏

（1.陕西中医学院 药学院，陕西 咸阳 712046；2.陕西丽彩集团咸阳丽彩医药有限公司，陕西 咸阳 712000）

桦黄是多孔菌科滴孔菌属植物桦滴孔菌Piptoporus betulinus（Bull.ex.fr）Karst的子实体[1]，具有消积、化疲、抗癌的功效，主要用于治疗小儿食积、食管癌、胃癌、子宫癌、等。桦黄主要生长在海拔2 300 m以上病害的桦树上，在秦岭南北坡上均有发现，系陕西民间习用药材。外观为不规则块状物或呈瘤状，无柄，表面有不规则的沟痕及深裂，断面黄色。桦黄中主要含游离糖、糖醇、有机酸、甾醇等，药理研究其具有一定的抗肿瘤活性[2-3]。多糖是中药材中普遍存在的活性成分，具有免疫调节、抗肿瘤、降血糖血脂、抗衰老等药理作用[4-6]，在保健食品和医药应用等方面具有很广的开发应用价值。该试验优化桦黄多糖的提取工艺，以便更好地开发和利用这一药用资源，并初步研究了桦黄多糖的抗氧化性质。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

无水乙醇、乙醚、丙酮、浓硫酸、苯酚均为分析纯：天津科密欧化学试剂开发中心。

桦黄采自陕西省秦岭山，经陕西中医学院药学院宋逍副教授鉴定为桦黄中药材。

1.2 仪器与设备

4K15台式离心机：美国Sigma公司；UV-2501PC紫外可见分光光度仪：日本岛津公司；RE-6000旋转蒸发仪：上海亚荣仪器有限公司；SHZ-D（Ⅲ）循环水式真空泵：巩义市予华仪器有限责任公司。

1.3 方法

1.3.1 桦黄多糖的提取工艺流程

图1 桦黄多糖提取工艺流程Fig.1 Polysaccharide extraction process from P.betulinus

将桦黄药材干燥至质量恒定，粉碎，过60目筛。准确称取桦黄粉5 g，然后将其用无水乙醇进行脱脂处理，按一定料液比加入水加热提取，提取多次，合并提取液，抽滤、离心分离。滤液按生药体积比1∶1浓缩后，加无水乙醇醇沉，静置过夜，真空抽滤，真空干燥，可得桦黄粗多糖[7]。

1.3.2 提取工艺条件的选择

采用单因素试验法优化最佳提取工艺[8]。在提取桦黄多糖试验中，影响产品收率的因素很多，通过前期试验考察得出温度、时间、液料比、提取次数等对多糖提取率的影响较大。

（1）提取温度的选择

准确称量粉碎好的桦黄，平行称取5份，在液料比为10∶1（mL∶g），时间1 h，重复提取2次，在50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃不同温度条件下进行桦黄多糖提取试验，提取液合并后浓缩，浓缩液再用5倍体积无水乙醇醇沉，研究不同的提取温度对多糖提取率的影响。

（2）提取时间的选择

准确称量粉碎好的桦黄，平行称取5份，在液料比为10∶1（mL∶g），温度为80 ℃，重复提取2次，在60 min、75 min、90 min、105 min、120 min不同时间条件下进行桦黄多糖提取试验，提取液合并后浓缩，浓缩液再用5倍体积无水乙醇醇沉，研究不同的提取时间对多糖提取率的影响。

（3）液料比的选择

准确称量粉碎好的桦黄，平行称取5份，在温度为80 ℃，提取时间105 min，重复提取2次，在9∶1、10∶1、11∶1、12∶1、13∶1（mL∶g）不同液料比条件下进行桦黄多糖提取试验，提取液合并后浓缩，浓缩液再用5倍体积无水乙醇醇沉，研究不同的液料比对多糖提取率的影响。

（4）提取次数的选择

准确称量粉碎好的桦黄，平行称取5份，在温度为80 ℃，提取时间105 min，液料比16∶1（mL∶g），在1、2、3、4、5不同提取次数条件下进行桦黄多糖提取试验，提取液浓缩，浓缩液再用5倍体积无水乙醇醇沉，研究不同的提取次数对多糖提取率的影响。

1.3.3 桦黄多糖含量及提取率计算

（1）多糖含量的测定

按照文献[9-11]报道，多糖含量的测定应用苯酚-硫酸法，以葡萄糖为标准品，绘制标准曲线为：A=1.033 8C+0.020 5，R2=0.999 2。质量浓度范围在0.08～1.00 mg/mL范围内，线性关系良好。

（2）多糖提取率计算

准确称量粗多糖，配制溶液，依照苯酚硫酸显色方法显色，测量吸光度值，计算多糖提取率。

1.3.4 桦黄多糖对DPPH·的清除作用[12]

DPPH·是一种稳定的自由基，其乙醇溶液呈紫色，在可见光区最大吸收峰为517 nm，当DPPH·溶液中加入自由基清除剂后，DPPH·溶液颜色变浅，可以用于评价自由基清除剂清除自由基的能力，DPPH·清除率计算公式：

式中：A空白为1.0 mL DPPH·溶液+1.0 mL 无水乙醇吸光度值；A样品为1.0 mL多糖溶液+1.0 mL DPPH·溶液吸光度值；A对照为1.0 mL多糖溶液+1.0 mL无水乙醇溶液吸光度值。

配制1×10-4mol/L的DPPH溶液，配制不同质量浓度多糖溶液，分别吸取待测多糖溶液1.0 mL，加入DPPH·溶液1.0 mL，混合均匀，在暗处放置30 min。以无水乙醇为空白，测定波长517 nm处的吸光度值，得到A样品。按上述要求再分别测得A空白和A对照，带入式（2）中，计算不同质量浓度条件下桦黄多糖对DPPH·的清除率。

2 结果分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 温度对多糖提取率的影响

图2 温度对桦黄多糖提取率的影响Fig.2 Effect of temperature on P.betulinus polysaccharide extraction rate

图2表明，当操作温度＜80 ℃时，多糖的提取率快速增加，当提取温度＞80 ℃时，提取率逐渐呈下降趋势，因此确定最佳提取温度为80 ℃。

2.1.2 提取时间对多糖提取率的影响

图3 时间对桦黄多糖提取率的影响Fig.3 Effect of time on P.betulinus polysaccharide extraction rate

图3表明，当提取时间在60～105 min之间时，多糖的提取率快速增大，＞105 min则改变不大，此时多糖的提取率随着时间的增加变化很小，因此选择提取时间为105 min。

2.1.3 液料比对多糖提取率的影响

图4 液料比对桦黄多糖提取率的影响Fig.4 Effect of liquid solid ratio on P.betulinus polysaccharide extraction rate

图4表明，液料比在达到12∶1（mL∶g）之前，多糖提取率增幅较大，超过12∶1（mL∶g）之后则变化不大，此时绝大部分多糖已经被溶出，因此选择液料比为12∶1（mL∶g）左右。

2.1.4 提取次数对多糖提取率的影响

图5 提取次数对桦黄多糖提取率的影响Fig.5 Effect of extraction times on P.betulinus polysaccharide extraction rate

图5表明，提取次数＞2次时，多糖提取率曲线变化趋势已趋于平缓，为了减少后期浓缩的困难以及从节约能源的角度考虑，选择提取次数2次较为理想。

2.2 最优提取工艺条件

单因素优化试验确定水提法提取桦黄多糖的最优提取工艺为水液比12∶1，温度80 ℃，时间105 min，提取2次。按照此工艺重复操作3次，提取的桦黄多糖的平均含量为65 mg/g。

2.3 桦黄多糖的抗氧化性研究

如图6所示，桦黄多糖对DPPH·的清除率随着质量浓度的增加，清除率呈上升趋势，在4.5 mg/mL时达到最大，为92.02%。多糖质量浓度继续增大对DPPH·的清除率基本变化不大，说明桦黄多糖对DPPH·具有一定的清除性，并且随着多糖质量浓度增加，抗氧化性增强。桦黄多糖具有一定的抗氧化性，需要进一步深入研究。

图6 不同质量浓度的桦黄多糖对清除DPPH影响Fig.6 Effect of different concentration of P.betulinus polysaccharide on DPPH scavenging activity

3 结论

对桦黄多糖的提取工艺进行了优化研究，最终得到了桦黄多糖提取最佳工艺为提取温度80 ℃，提取时间105 min，液料比12∶1（mL∶g），提取2次。在此工艺条件下，重复操作，桦黄多糖的平均含量为65 mg/g；对桦黄多糖进行了抗氧化性研究，结果表明，桦黄多糖对自由基DPPH·具有一定的清除作用。本研究结果对桦黄多糖分离纯化以及结构解析、药理活性等进一步研究具有一定的参考价值。

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