椰子水与菠萝汁生产细菌纤维素的对比研究

李 斌，钟春燕，王锡彬，王志国，向 东*

（1.海南大学 食品学院，海南 海口 570228；2.海南椰国食品有限公司，海南 海口 570311）

海南自1997年开始，利用丰富的椰子水资源作为培养基，以木醋杆菌（Acetobacter xylinum）为菌种生产细菌纤维素凝胶食品，商品名称为椰纤果或椰子纳塔，通常由菠萝汁生产的纳塔称之为菠萝纳塔，由椰子水生产的纳塔称之为椰子纳塔。海南目前主要以椰子水进行纳塔生产，年生产能力将近30万t，产值超过10亿元，是近年来海南新兴的食品工业的支柱产业。

关于细菌纤维素研究目前集中于基础发酵方面，如通过诱变筛选高产菌株[1-2]、优化培养基配方[3-5]、发酵工艺的优化等[6-11]。采用非椰子水发酵生产细菌纤维素食品近年来也有报道[12-13]，但限于产业链区域分布的关系，均未形成产业化规模。海南地区利用椰子水生产细菌纤维素历史接近20年，近年来随着椰子原料的缺乏和价格上涨，逐步有纳塔生产企业探索采用菠萝汁、芒果汁生产细菌纤维素凝胶，但未进行深入的研究。本研究将椰子水和菠萝汁作为主要原料，从前期发酵产酸、发酵周期以及细菌纤维素密度等方面进行了全面对比，对于利用非椰子水资源生产细菌纤维素凝胶具有重要的参考意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料

细菌纤维素凝胶生产菌：木醋杆菌（Acetobacter xylinum）HN001，海南大学食品综合实验室保藏；椰子水、菠萝汁前期发酵产酸菌：木醋杆菌（Acetobacter xylinium）YG002，海南椰国食品有限公司保藏。

硫酸铵、硫酸镁、磷酸二氢钾、氢氧化钠等均为分析纯：上海国药集团；生化试剂蛋白胨：上海生工公司。

椰子水：取自海口本地市售的新鲜椰子；菠萝汁：由海口本地市售的新鲜菠萝打浆过滤获得。

1.1.2 培养基

菌株HN001、YG002种子液培养基：新鲜椰子水70 mL，硫酸铵0.1 g，硫酸镁0.1 g，磷酸二氢钾0.1 g，蔗糖4.0 g，蛋白胨0.1 g，蒸馏水30 mL，pH值自然，100 ℃灭菌5 min。细菌纤维素凝胶生产培养基：

（1）椰子水培养基：发酵椰子水50 mL，硫酸铵0.1 g，硫酸镁0.1 g，磷酸二氢钾0.1 g，蔗糖3.0 g，蒸馏水50 mL，用NaOH调节pH值至4.1，100 ℃灭菌5 min。

（2）菠萝汁培养基：发酵菠萝汁50 mL，硫酸铵0.1 g，硫酸镁0.1 g，磷酸二氢钾0.1 g，蔗糖3.0 g，蒸馏水50 mL，用NaOH调节pH值至4.1，100 ℃灭菌5 min。

1.2 仪器与设备

SW-CJ-1F单人双面净化工作台：苏州净化设备有限公司；YX280A手提式不锈钢蒸汽消毒器：上海三申医疗器械有限公司；SHP-1500生化培养箱：上海精宏实验设备有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 前期发酵产酸

无论是椰子水还是菠萝汁，新鲜的果汁用于生产细菌纤维素效果较差，这是因为其中缺乏木醋杆菌产细菌纤维素所需的有机酸、微生物菌体等重要营养基质，不同有机酸对木醋杆菌产纤维素的影响也不尽相同[14]。鉴于有机酸对木醋杆菌产纤维素的重要影响，必须对椰子水、菠萝汁进行前期发酵才能作为细菌纤维素的培养基质使用，前期发酵液的酸度对于后续发酵生产细菌纤维素凝胶具有重要的参考意义，将酸度作为前期发酵的主要指标进行测定，酸度越高表明前期发酵效果越佳。目前椰子纳塔工业化生产前主要采用自然发酵的方式，这种发酵方式操作简单，产酸量高，但由于自然感染的未知微生物，不能保证食品安全性和产品质量稳定性；菠萝汁与椰子水在成分上有较大差异（如还原糖、微量元素含量等），采用自然发酵的方式往往不能获得满意的结果，本研究菠萝汁前发酵采用接种产酸菌种进行发酵，旨在和现有的纳塔生产前期发酵工艺进行比较。

椰子水前期产酸：模拟目前椰子纳塔的生产工艺，剖开新鲜椰子，取椰子水，自然放置暴露于空气中进行自然发酵，采用GB/T 12456—2008《食品中总酸的测定》中的方法每天测定发酵椰子水的总酸含量[15]。

菠萝汁前期产酸：将新鲜的菠萝汁灭菌后接种木醋杆菌（Acetobacter xylinum）YG002，进行前期产酸发酵，采用GB/T 12456—2008《食品中总酸的测定》中的方法每天测定发酵菠萝汁的总酸含量。

将椰子水和菠萝汁前期产酸发酵的色泽、气味、总酸量进行对照。

1.3.2 细菌纤维素凝胶发酵生产周期的对比

按1.3.1所述前期发酵方法，将发酵的椰子水及发酵的菠萝汁按照1.1.2配制培养基，置于250 mL烧杯中，灭菌后接种木醋杆菌（Acetobacter xylinum）HN001静置培养。根据纳塔生产企业的标准规格，选择细菌纤维素凝胶厚度1.2 cm作为标准规格，比较细菌纤维素凝胶厚度达到1.2 cm时的发酵生产周期。

1.3.3 不同培养基对细菌纤维素凝胶纤维密度的影响

木醋杆菌在液体培养基中发酵获得的细菌纤维素凝胶是纤维素和水结合的状态，其基本结构是：纳米级别直径的细菌纤维束形成立体网络的骨架，网络间的孔隙充满水分，通常纤维素干质量占细菌纤维素凝胶总质量（湿质量）的1%以下，而水分质量往往超过99%。本研究对细菌纤维素凝胶密度作如下定义：单位体积内细菌纤维素凝胶（水合状态）的纤维素干质量。引入细菌纤维素凝胶密度及测定纤维素密度值，可以直接表征细菌纤维素在水合状态下的分布疏密情况。

按1.3.1所述前期发酵方法，将发酵的椰子水及发酵的菠萝汁按照1.1.2配制培养基，置于250 mL烧杯中，灭菌后接种5%（V/V）木醋杆菌（Acetobacter xylinum）HN001静置培养2～6 d，每天测定细菌纤维素凝胶的干质量及水合状态下的体积，计算纤维素密度。

细菌纤维素凝胶干质量（m）的测定：将细菌纤维素凝胶用蒸馏水洗涤3次后、置于80 ℃干燥至质量恒定，称质量。

细菌纤维素凝胶体积（v）的测定：取出按上述方法进行培养的细菌纤维素凝胶膜，用半干的湿布拭去其表面多余的水分，放入装有植物油的1 000 mL量筒中，根据量筒排出油的体积测定细菌纤维素凝胶的体积。细菌纤维素凝胶密度的计算公式如下：

式中：ρ为细菌纤维素密度，kg/m3；m为细菌纤维素干质量，kg；v为细菌纤维素凝胶体积，m3。

2 结果与分析

2.1 不同培养基发酵产酸分析

表1 椰子水随发酵时间的变化Table 1 Change of coconut water with fermentation time

将新鲜的椰子水暴露于空气中，由于椰子水中感染了空气中的微生物，这些微生物代谢后产生了大量的酸，新鲜的椰子水随发酵时间的增加产生了较大变化，结果见表1所示。由表1可知，椰子水颜色逐步由澄清透明变成乳白色，气味由椰子水原有的清香味变成具有较浓酸味，总酸随发酵时间的延长有显著增加，但发酵8 d后总酸增加量开始延缓。

将新鲜的菠萝汁经灭菌后接入前期产酸发酵菌种木醋杆菌（Acetobacter xylinum）YG002进行发酵，接种量5%（V/V）。新鲜的菠萝汁随发酵时间的增加产生了较大变化，结果见表2所示。由表2可知，菠萝汁颜色变化不大，气味由菠萝汁原有的浓郁香味变成具有较浓酸味，总酸初始量较高，随发酵时间的延长有显著增加，但发酵3 d后总酸增加量开始延缓，发酵至5 d后产酸量不再增加，菠萝汁发酵后总酸量大于椰子水产酸量。

表2 菠萝汁随发酵时间的变化Table 2 Change of pineapple juice with fermentation time

2.2 细菌纤维素凝胶生产周期的对比

根据纳塔生产企业产品的一般规格，选择细菌纤维素凝胶厚度为1.2 cm时，采用椰子水培养基采用自然发酵10 d主要培养基质，菠萝汁培养基采用前期发酵5 d作为主要培养基质，接种5%（V/V）木醋杆菌（Acetobacter xylinum）HN001静置培养，比较2种培养基发酵细菌纤维素凝胶生产周期，结果如图1所示。

图1 不同培养基生产周期对比Fig.1 Comparison of production period with different culture mediums

由图1可知，椰子水培养基细菌纤维素凝胶厚度生长到≥1.2 cm时需要7 d，这个生产周期与目前椰子纳塔生产企业的生产周期一致。而以菠萝汁作为培养基生长到同等厚度则只需要5 d，比通常的椰子纳塔生产周期缩短了2 d。这可能是因为菠萝汁在接种木醋杆菌（Acetobacter xylinum）YG002后发酵后，其发酵液中的有机酸、微生物菌体等能够促进木醋杆菌（Acetobacter xylinum）HN001快速代谢产生细菌纤维素，而自然发酵的椰子水其中虽然也含有较多有机酸，但不能加速HN001代谢产生细菌纤维素。

2.3 不同培养基细菌纤维素凝胶纤维素密度的对比

将椰子水发酵10 d，菠萝汁发酵5 d，获得最大产酸量后，按照1.3.2所述的方法进行细菌纤维素凝胶的培养，第2天至第6天每天测定细菌纤维素凝胶的干质量及体积，计算纤维素密度。不同培养基细菌纤维素的密度与发酵时间的关系如图2所示。

图2 不同培养基纤维素密度的对比Fig.2 Comparison of cellulose density with different culture mediums

由图2可知，椰子水细菌纤维素的纤维素密度始终大于菠萝汁细菌纤维素的密度，表明以发酵的椰子水为主要原料生产细菌纤维素时形成的凝胶更为致密，以手按压，感觉椰子水培养基生产的细菌纤维素凝胶质地较硬，而菠萝汁培养基生产的细菌纤维素凝胶质地偏软。这说明以发酵的椰子水作为培养基，可能更适合木醋杆菌的增殖，能够形成更高的菌体密度，因此在菌株代谢产纤维素时单位体积获得了更高的产量。而菠萝汁经发酵后，具有更高的酸度，能够促进木醋杆菌迅速代谢细菌纤维素，但过高的酸度反而可能会抑制产木醋杆菌的增殖，最终导致菌体密度较低，所形成的细菌纤维素密度也较椰子水培养基低。

在同等体积下，细菌纤维素凝胶总质量（湿质量）的变化取决于纤维素干质量的变化，但由于纤维素干质量占细菌纤维素凝胶总质量的比例较低（通常1%以下），直接测定其湿质量的变化来表征细菌纤维素产量存在较大的测量误差。农业标准NY/T 1522—2007《椰子产品椰纤果》对细菌纤维素凝胶中的粗纤维的含量（质量百分比）作出了规定[16]，但这一指标无法直观表征纤维素在细菌纤维素凝胶水合状态下的分布情况。通过对不同培养基下细菌纤维素凝胶密度的变化研究，不仅可以获得微生物产纤维素的分布信息，同时对纳塔产品出现的质构变化可以作出合理解释，如纤维素密度高的纳塔产品质地较硬，而纤维素密度低的纳塔产品质地偏软等。

3 结论

海南自1997年开始，利用丰富的椰子水资源作为培养基，以木醋杆菌为菌种生产细菌纤维素凝胶，随着椰子加工产业规模日渐增长，本省的椰子水资源已逐步不能满足生产需要。利用丰富的热带水果资源，特别是价值低廉的残次果资源，作为培养基生产细菌纤维素是解决椰子水资源不足的研究方向。

本研究利用热带水果资源菠萝汁作为生产培养基，与传统的椰子水培养基进行了对比研究，结果表明，利用菠萝汁生产细菌纤维素具有一定的优势，如前期发酵酸度较高，能够加速木醋杆菌分泌产生细菌纤维素，从而获得较短的生产周期。此外，利用固定的菌种进行前期产酸发酵替代自然发酵对于纳塔生产的质量稳定性、食品安全性，以及较高的酸度对于防止后续发酵生产过程中的杂菌污染，都具有一定的优势。利用菠萝汁作为培养基，其在增殖木醋杆菌菌体方面弱于椰子水，从而导致产品纤维素密度较低，这对于最终产品的品质可能会有一定影响，如何克服这一劣势，是今后利用非椰子水资源生产细菌纤维素需要解决的问题之一。

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