东北酸菜品质评定及发酵优良菌株筛选

赵国忠，王梦颖，韩俊燕，赵建新，张 灏，陈 卫*

（江南大学食品学院，江苏 无锡 214122）

东北酸菜因其鲜咸酸爽、脆嫩可口、开胃解腻，并能帮助消化等优点，成为盛行于东北的一种腌制菜品[1]。酸菜营养丰富，含有纤维素、矿物质及人体代谢不可缺少的有机化合物，如乳酸、胆碱、乙酰胆碱、维生素C、维生素B12等，其不仅风味独特，而且具有调节血液平衡、调节胆固醇、预防动脉粥样硬化等生理功效[2]。东北地区冬季气候寒冷，腌制贮存大白菜可延长其保藏期，在酸菜腌制过程中，发酵液中的微生物起了关键的作用，它们可发酵碳水化合物产酸，促进酸菜独特风味及其特殊生理功能的形成。

近年来，岳喜庆等[3-4]对东北酸菜的质地变化、感官品质、各种理化指标及风味变化研究较为突出，并且确定了自然发酵酸菜的5种主体风味成分：二甲基二硫、二甲基三硫、（E，Z）-2,6-壬二烯醛、乙醛和2-戊基呋喃。SUZZI G等[5]对酸菜中的有害物质如生物胺有深入的研究。但还未发现有关于东北酸菜菌株微生态与感官质量、理化特性之间的联系的相关研究，二者之间的相关联系尚不明确。本实验对不同纬度东北三省多个地区的酸菜进行样品采集、感官评定，探讨其感官品质与其理化指标之间的关系，寻找其中的相互联系，并分析其原因。此外对感官得分高的酸菜样品中的优良菌株进行分离筛选，以期从天然发酵酸菜产品中寻找优质菌种资源，为实现优良菌株微生态的有效利用奠定良好基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

东北酸菜：从东北三省的普通家庭腌制酸菜中随机采集24份成熟酸菜样品，样品具体来源及对应编号见表1。

表1 24份东北酸菜样品的来源与编号Table 1 24 parts of the sources and numbers of Northeast sauerkraut samples

分析所用试剂均为市售分析纯；有机酸检测所用试剂为市售色谱纯；乳酸细菌培养基（MRS）参考文献[6-7]配制。

1.2 仪器与设备

FE-20精密pH计：梅特勒-托利多仪器有限公司；DK-S12恒温水浴锅：上海森信实验仪器有限公司；UV1800紫外可见分光光度计：日本岛津公司；1525型高效液相色谱仪：美国沃特斯公司；ZHJH-C1115B超净工作台：上海智诚分析仪器制造有限公司；MLS-3750立式压力蒸汽灭菌锅：日本SANYO公司；SP-250生化培养箱：南京实验仪器厂；DM 2000荧光显微镜：徕卡仪器（德国）有限公司；T100 Thermal Cycler PCR仪：美国伯乐BIO-RAD公司。

1.3 试验方法

1.3.1 酸菜样品感官评定方法

取出一定量酸菜样品放置于洁净瓷盘中，组织一个由20位专业感官评定人员组成的感官评定小组，分别从色泽、气味、滋味、质地等4个方面对酸菜样品进行评价，评定采用打分制，评分标准见表2，共13个评价项目，总分为130分。

1.3.2 理化指标检测方法

酸菜样品中各种理化指标的测定方法如下：总酸的测定方法参考国标GB/T 12456—2008《食品中总酸的测定》；还原糖的测定方法参考国标GB/T 5009.7—2008《食品中还原糖的测定》；亚硝酸盐的测定采用盐酸萘乙二胺法，参考国标GB/T 5009.33—2010《食品安全国家标准食品中硝酸盐与亚硝酸盐的测定》；有机酸测定方法参考国标GB/T 5009.157—2003《食品中有机酸的测定》。

酸菜样品中氨基酸种类及含量的测定送至江南大学检测中心进行。

表2 酸菜感官评定标准Table 2 Sensory evaluation standard of sauerkraut

1.3.3 菌株筛选及鉴定

菌株筛选方法[8]：将不同酸菜样品汁液分别用生理盐水进行梯度稀释，选择10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6这6个稀释度的菌液在MRS平板上进行涂布，然后在37 ℃的恒温培养箱中培养24～36 h，观察长出的单菌落，挑取不同形态、大小的菌落进行划线纯化，三次分离纯化之后，对菌株进行革兰氏染色镜检，并确定菌株形态，将镜检后的菌株接种于MRS液体管中进行传代培养，然后于MRS斜面培养基中划线培养，最后于4 ℃冰箱保存，备用。

菌株鉴定方法：采用16S rDNA序列分析法对筛选到乳酸菌进行序列分析，确定其种属。将活化好的菌液，参考文献[9]中的基因组提取方法，对菌株的全基因组DNA进行提取，对得到的基因组DNA的16S rDNA区域进行聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增，选择细菌通用引物进行扩增，上游引物27F序列：5′-AGAGTTTGATCCTGGCCTCA-3′，下游引物1492R序列：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′，扩增片段分别为1 500 bp。PCR体系50 μL：10×buffer 5 μL；三磷酸脱氧核糖核苷（deoxyribonucleoside triphosphate，dNTP）5μL；上游引物（25μmol/L）0.5 μL；下游引物（25 μmol/L）0.5 μL；TaqDNA聚合酶（250 U）0.5 μL；模板DNA 1.5 μL；ddH2O 37 μL。PCR扩增条件为：95 ℃、3 min；95 ℃、10 s；55 ℃、30 s；72 ℃、1 min；72 ℃、5 min，2～4步进行30个循环。扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测其纯度及浓度，将达到测序要求的扩增产物送至上海桑尼生物科技有限公司进行测序，将测序结果在美国国家生物技术信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）上用Blast进行比对，并确定其种属。

2 结果与分析

2.1 东北不同地区酸菜的感官评定

对采自东北三省不同地区的24个酸菜样品进行感官分析，评价采用打分制，分数越高则样品感官质量越好、接受度越高，对每个酸菜样品的得分结果进行分析，统计计算平均总得分，其中总分为130分，感官评价得分见表3。

表3 样品感官得分Table 3 Sensory scores of samples

由表3可知，感官得分最高的3个样品分别为来自辽宁省的L-6、L-5及吉林省的G-5，这三个样品无论从色泽、滋味、质地上都优于其他样品，感官评定得分最低的样品分别为来自黑龙江延寿的H-2、吉林省G-11及黑龙江省的H-4，相对其他样品而言，它们的综合感官质量比较低。

整体分析感官数据可以发现，辽宁省的样品中75%样品的感官得分高于平均分，其比例在3个省份中最高，而黑龙江省的酸菜样品的感官得分总体较低，吉林省样品居中，说明样品的感官质量在省份之间差异较大，整体而言，辽宁省酸菜样品感官质量最高。

2.2 总酸含量结果分析

酸菜在发酵过程中，微生物经过三羧酸循环和无氧呼吸会发酵产生乳酸、乙酸等各种有机酸，酸的产生不仅可以改善酸菜的风味，而且能有效抑制腐败菌的生长[10-11]，现采用酸碱滴定法对酸菜样品中的总酸含量进行测定，测定结果见图1。

由图1可知，不同地区的酸菜样品总酸含量差异较大，其中感官评定得分最高的L-6具有较高的酸度，达到0.18 mol/L。整体分析，辽宁省所有样品的总酸含量均高于平均值，而吉林省酸菜样品总酸含量高于样品平均值的比例仅为36.36%，这与各省的整体感官质量变化趋势相符合。同时，观察数据可以发现，感官质量比较低的样品H-2、H-4、G-11的总酸值均低于平均值。由上述分析可知，样品总酸含量与感官质量之间具有相同的变化趋势，总酸含量高的产品感官得分较高。分析出现该现象的原因可能是因为辽宁省所处纬度较其他三省要低，冬季温度略高于其他省，在酸菜发酵过程中有益微生物的量最多，从而发酵产生更多的酸。

图1 不同东北酸菜样品中总酸含量Fig.1 Total acid content in different Northeast sauerkrauts

2.3 还原糖含量结果分析

对酸菜样品中的还原糖含量进行测定，测定结果见图2。

图2 不同东北酸菜样品中还原糖的含量Fig.2 Reducing sugar content in different Northeast sauerkrauts

由图2可知，吉林省样品G-4的还原糖含量最高，其次是G-5，还原糖含量最低的样品为G-2，吉林省样品中还原糖含量高于平均值的样品比例达到72.72%，分析比较数据，发现还原糖的含量与感官品质没有明显的联系。

2.4 氨基酸结果分析

氨基酸是酸菜样品中主要的香味、风味来源，发酵蔬菜中含有的氨基酸的鲜味远超过单纯的谷氨酸钠的鲜味[12]。分别对感官得分较高和较低的2组样品进行氨基酸种类和含量的测定，其氨基酸总量测定结果见图3，L-6样品中具体氨基酸种类和含量见表4。

图3 四组酸菜样品中氨基酸的含量Fig.3 Amino acid content in four kinds of Northeast sauerkrauts

由图3可知，样品之间氨基酸含量存在较大差异，其中感官得分最高的样品L-6的氨基酸含量最高，达到2 212 mg/L，其次是G-11、H-2，分别达到1 398 mg/L和1 179 mg/L，氨基酸含量最低的样品为L-5，含量为842 mg/L。由此得出，感官得分高的酸菜样品氨基酸含量较高，微生物可能在氨基酸代谢过程中发挥了重要的作用。

表4 L-6样品中氨基酸种类和含量Table 4 Types and contents of amino acids in L-6 sample

由表4可知，L-6样品中含有17种游离氨基酸，其中丙氨酸含量最高，达到629.46 mg/L，占总氨基酸量的28.46%，半胱氨酸含量最低，为1.05 mg/L，仅占样品氨基酸总量的0.05%，此外，样品中含有除了色氨酸以外的其他7种人体必需氨基酸，总量达到422.89mg/L，占总氨基酸含量的30.25%，杜书等[13]对自然发酵酸菜中游离氨基酸进行测定，同样也发现其中含有7种人体必需氨基酸。以上数据表明，酸菜具有较高的营养价值。

2.5 亚硝酸盐结果分析

传统酸菜采用盐渍、发酵法进行生产，蔬菜中的硝酸盐易被发酵过程中的微生物转化为亚硝酸盐，而它是一种致癌物前体，长期大量食用会对身体健康造成威胁[14-15]。采用盐酸萘乙二胺法[16]对24个酸菜样品中亚硝酸盐含量进行检测，测定结果见图4。

图4 不同东北酸菜样品中亚硝酸盐含量Fig.4 Nitrite content in different Northeast sauerkrauts

由图4可知，感官得分、酸度较高的酸菜样品L-5、L-6的亚硝酸盐含量很低，几乎为零，而感官得分、酸度较低的样品H-4，亚硝酸盐含量较高，达到7.5 mg/kg。同时还发现，黑龙江省的所有酸菜样品的亚硝酸盐含量均高于24组样品平均值，而其感官得分在三个省中也最低，酸度也偏低。由此可推测在感官质量、酸度和亚硝酸盐含量三者之间存在重要的相互关系，即酸菜样品的感官质量与酸度呈正比，与亚硝酸盐含量呈反比。推测感官得分较高的酸菜发酵过程中有益菌含量高，产酸量大，进而腐败菌生长较少，亚硝酸盐含量低。

2.6 发酵微生物菌株的分离鉴定

酸菜发酵过程中微生物群系起了重要的作用，其中乳酸菌占主导地位[17-19]，对感官得分较高的酸菜样品中的乳酸菌进行筛选。实验分离得到8株乳酸菌，对其16S rDNA片段扩增并进行测序，在NCBI上进行Blast比对分析对应的序列，比对结果见表5。

表5 菌株序列比对结果Table 5 Sequence results of strains

由表5可知，在筛选出的8株细菌中有6株植物乳杆菌、1株鼠李糖乳杆菌和1株布氏乳杆菌，这三种乳杆菌均能够发酵白菜中的糖分产生乳酸等有机酸，其中，植物乳杆菌为主导发酵菌株，在发酵体系中丰度较大，能够快速产生乳酸及其他风味物质。

3 结论

实验结果显示，不同纬度的酸菜样品感官质量差异较大，纬度较高省市的酸菜感官质量低于纬度低地区。纬度越高的地区冬季气温越低，在过低的温度时，微生物活性较低、生长缓慢，导致发酵体系中有益发酵菌株含量较低，不利于有机酸及其他风味物质的形成，也更易产生各种腐败菌，导致亚硝酸盐含量增加。酸菜样品的感官质量与其酸度、氨基酸、亚硝酸盐含量等理化特性有密切的联系，感官质量越高的样品其酸度、氨基酸含量相对越高，亚硝酸盐的含量相对越低，其在发酵过程中可能有较大的乳酸菌丰度，如植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和布氏乳杆菌均能发酵产酸、醛、酯类物质，经过其发酵的蔬菜，不仅碳水化合物和蛋白质类物质得到进一步分解，利于人体消化吸收，而且其酸类物质及其相关代谢产物进而会抑制生产亚硝酸盐的腐败菌的生长。

从酸菜样品中成功筛选出能发酵产生有机酸及其他风味物质的植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、布氏乳杆菌，对酸菜发酵过程中存在的微生物菌系有了一定的了解，有助于后期优质高产酸菜发酵菌种的筛选，为中国发酵酸菜的工业化奠定良好的基础。

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