连接蛋白43 mRNA在妊娠期糖尿病胎盘组织中的表达及意义

付长霞++++++张春香++++++刘立昌++++++吕世军

[摘要] 目的 探讨连接蛋白43（Connexin43， Cx43）mRNA在妊娠糖尿病（gestational diabetes mellitus， GDM）胎盘组织中的表达。 方法 收取GDM未治疗组18例，GDM治疗组22例，正常妊娠组12例， HE染色观察各组胎盘组织标本细胞滋养细胞、合体滋养细胞等的变化。应用RT-PCR方法检测Cx43 mRNA在三组胎盘组织中的表达。结果 组织学观察显示GDM未治疗组的胎盘组织中细胞滋养细胞、合体滋养细胞明显多于GDM治疗组及正常对照组。三组胎盘组织中均有Cx43 mRNA的表达，Cx43 mRNA在GDM未治疗组较正常妊娠组和GDM治疗组降低，具有统计学意义（P<0.05）。结论 Cx43 mRNA在GDM胎盘中的低表达是引起胎盘结构和功能变化的重要因素，在GDM的发病过程中起重要作用。

[关键词] 妊娠期糖尿病；胎盘；连接蛋白43；RT-PCR

[中图分类号] R714.2 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2014）10-0050-04

妊娠期糖尿病（gestational diaetes mellitus，GDM）是指妊娠期首次发生和发现的不同程度的糖代谢异常，包括妊娠前已经存在但被漏诊的孕前糖尿病者以及孕期伴随发生的糖耐量异常者[1]，我国GDM发病率为1%～5%[2]。缝隙连接（gap junction， GJ）是由相邻细胞间两侧质膜的连接子（Connexon）相连接形成的通道，每个连接子是由六个形状相同、功能一致的蛋白分子亚基，即连接蛋白（Connexin，Cx）围绕中央孔道排列形成的亲水通道，是目前已知的细胞间直接进行物质交流的惟一的膜通道结构。GJ和细胞缝隙连接通讯（gap junction intercellular communication，GJIC）可以调控细胞增殖、细胞凋亡，参与细胞的生长抑制和转化。连接蛋白43（Cx43）作为主要的连接蛋白，是目前人体分布最广的一个连接蛋白[3]。目前国内外文献中鲜有关于Cx43在GDM胎盘中表达情况的研究报道。本文的研究目的是观察Cx43 mRNA在GDM胎盘中的表达，探讨Cx43 mRNA在GDM胎盘中的调控作用，为阐明Cx43在GDM发病中的作用机制提供理论基础。

1资料与方法

1.1一般资料

选择2011年7月～2012年6月于潍坊市中医院产科住院分娩的妇女，均排除孕前有糖尿病病史。参考2010年美国糖尿病学会（American Diabetes Association，ADA）的诊断标准[4]将患者分为三组，GDM未治疗组18例； GDM治疗组22例；同期分娩的正常妊娠妇女共12例作为对照组，三组孕妇年龄、分娩孕周比较，差异无统计学意义（P>0.05）。三组孕妇均无烟酒嗜好，既往无高血压、血液病、肾脏疾病、代谢性疾病等病史。

1.2研究方法

1.2.1标本采集 三组孕妇均于胎盘娩出后胎盘称重，直视下选取胎盘母面中央带与中间带组织（避开钙化、机化灶），将其分为两部分：一部分切成约2.0 cm ×2.0 cm ×0.5 cm小块组织，用4%福尔马林固定，做石蜡切片；另一部分切成约0.5 cm3的小块，置于DEPC处理过的冻存管中，标记后放入-70℃冰箱低温保存备用。

1.2.2 组织蜡块的制作及HE染色 固定，洗涤，脱水，透明，浸蜡，包埋，石蜡切片常规脱蜡入水，水洗，苏木素染色，伊红染色，脱水透明，中性树胶封片，显微镜观察染色结果。

1.2.3胎盘组织Cx43 mRNA 表达水平的检测 ①总RNA 的分离 采用UNIQ-10柱式Trizol总RNA抽提试剂盒，提取胎盘组织总RNA。②逆转录聚合酶链反应（RT-PCR） ：采用M-MLV第一链cDNA合成试剂盒，根据文献设计Cx43 RT-PCR引物：上游：5'-ATGAGCAGTCTGCCTTTCGT-3'；下游：5'-TCTGCTTCAAGTGCATGTCC-3'；扩增产物长度为249 bp。RT-PCR 在50 μL 反应体系中进行，按37℃ 60 min进行逆转录，94℃ 4 min灭活逆转录酶和PCR 预变性， 94℃15 s、58 ℃30 s和72℃90 s完成40个循环的PCR。③PCR琼脂糖凝胶电泳并分析：PCR反应结束后，加入1%的琼脂糖凝胶样品孔中在100V恒压下进行15 min电泳；电泳结束后取出凝胶，于BiospectrumAC 凝胶成像分析系统下照相并扫描分析测定荧光密度读数值。

1.3 结果判断

1.3.1 HE染色结果判定 三组标本中，每张切片在高倍（400×）视野下随机选取不重复的100个终末绒毛，共观察终末绒毛5200个，观察细胞滋养细胞、合体滋养细胞数量。

1.3.2 胎盘组织Cx43基因的RT-PCR 结果判定 应用RT-PCR法从正常妊娠成熟胎盘和GDM胎盘组织中成功提取总RNA，然后以总RNA为模板成功扩增出Cx43目的基因，产物长度约为249 bp，结果显示在三组胎盘组织中均有Cx43 mRNA的表达，内参照β-actin的目的基因产物长度约为116 bp，电泳结果通过BiospectrumAC凝胶图像扫描仪对DNA电泳条带作光密度分析，用均数±标准差（x±s）表示。

1.4 统计学分析

运用SAS8.0统计软件进行数据处理和分析。计数资料采用基于二项分布的两样本率检验，计量资料采用方差分析，两两比较采用SNK-q检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HE染色

三组标本中观察终末绒毛中合体滋养细胞和细胞滋养细胞阳性率及比较结果见表1。GDM未治疗组与GDM治疗组、GDM未治疗组与正常对照组比较，差异有统计学意义（P 均<0.05）。GDM治疗组与正常对照组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。endprint

正常妊娠组：绒毛大小均匀，分布及形态规则，绒毛滋养细胞单层分布，合体滋养细胞和细胞滋养细胞少见，见图1。GDM治疗组：光镜下见成熟绒毛居多，合体滋养细胞和细胞滋养细胞少见，见图2。GDM未治疗组：镜下见末梢绒毛有的成熟，也有不成熟的区域。绒毛滋养细胞单层分布，合体滋养细胞明显增多，细胞滋养细胞增多，见图3。

表1 三组胎盘组织各指标阳性率间比较（二项分布正态近似法）

2.2 胎盘组织Cx43基因的RT-PCR

通过BiospectrumAC凝胶图像扫描仪对DNA电泳条带作光密度分析（电泳结果见图4），用均数±标准差（x±s）表示，经方差齐性检验，各组总体方差齐，经单因素方差分析，各组间差异具有统计学意义（P<0.05），见表2。然后用SNK-q检验进行两两比较，GDM未治疗组分别与正常妊娠组和GDM治疗组相比，其Cx43 mRNA均明显降低，差异具有统计学意义（P<0.05）。结果说明与正常妊娠组和GDM治疗组相比，GDM胎盘未治疗组Cx43 mRNA的表达量明显减少。

3 讨论

GDM发病机制比较复杂，国内外许多学者从不同方面对其发病机制进行探讨，但到目前为止仍无明确的结论。胎盘是介于母体-胎儿之间的一个重要的临时性器官，具有物质交换、代谢、分泌激素、防御以及合成等功能，其结构和功能的完整性对维持妊娠有重要作用。本文组织学观察发现GDM未治疗组胎盘比GDM治疗组和正常妊娠组胎盘的合体滋养细胞和细胞滋养细胞增多、胎盘内未成熟绒毛或水肿绒毛间质内haufbauer细胞增多等，表现胎盘绒毛发育不成熟与先前报道一致[5，6]。

胚胎发育早期，细胞缝隙连接蛋白就开始表达，且这种表达受时空调节，一种缝隙连接蛋白表达的同时，另一种连接蛋白的表达可能正在关闭，这种现象在胚胎发育中很常见。出生后每种组织表达的缝隙连接蛋白的种类和数量基本稳定不变。缝隙连接的主要功能是介导细胞间的电偶联，传递动作电位，维持机体的电活动和机械收缩，保证活动的同步性；交换细胞间离子、营养物质、液体、维持细胞稳态；调控细胞的生长和分化；在胚胎的形成、生长和发育中调节细胞间信号的传递；环核苷酸、钙离子、磷酸肌醇等第二信使可以从已被激素激活的细胞通过缝隙连接进入并激活静止细胞，从而提高组织对激素的应答。

本文研究发现，Cx43 mRNA在GDM胎盘中的表达较正常妊娠胎盘明显减少。这可能是因为Cx43在转录前就存在缺陷。本文推测引起Cx43 mRNA低表达的原因可能是：①细胞中Cx43基因启动区的CpG岛甲基化。连接蛋白表达异常的主要原因是表遗传改变，连接蛋白基因启动区的CpG岛甲基化是连接蛋白表达下调的主要原因。因在Cx43表达丰富的正常组织中Cx43基因不存在甲基化，基因过度甲基化尤其位于启动子区域，是组织特异性基因表达缺失的一种共同机制，Cx43基因甲基化使Cx43基因异常表达，可使其在肿瘤细胞中失活，而表达减少甚至缺失。用去甲基化药物5-氮杂胞嘧啶出来Cx43阴性的宫颈癌Hela细胞，发现Cx43重新表达[7]。但甲基化抑制连接蛋白基因转录并不是唯一的原因，其他原因还未明确。②连接蛋白的基因突变：连接蛋白的表达可以抑制或诱导一些与生长有关的因子表达，如FGFR3、Her-2、IGF-1、P21、P27、IGFBP-4等。另外连接蛋白表达对一些分化相关因子的表达有影响。连接蛋白之所以会调控这些因子的表达，可能与这些因子的基因上存在连接蛋白反应元件（connexin reponse element，CxRE）有关[8]。连接蛋白本身异常影响了细胞的正常增殖分化。

胎盘组织中的细胞滋养细胞具有类似于肿瘤细胞的增殖特性。Cronier 等[9]用反义核苷酸技术证明了 Cx43在人滋养细胞的细胞-细胞通信、滋养细胞融合和分化过程中起着重要作用。Dunk等[10]用实验证明Cx43缝隙连接斑块在融合细胞滋养层表达，Cx43介导的GJIC在滋养层细胞融合过程中发挥重要的功能作用。Malassiné等[11]从人胎盘分离出滋养细胞进行体外培养，鉴别出不同的膜蛋白直接参与滋养层细胞融合：Cx43、ZO-1和Syncytins。本文研究发现Cx43 mRNA在GDM胎盘中低表达，可能直接导致细胞滋养细胞GJIC的结构和功能异常，细胞失去广泛的信号通讯，逃避正常的生长控制，最终导致细胞滋养细胞和合体滋养细胞的增多。胎盘合体滋养细胞是实现众多胎盘功能的场所，包括物质交换、新陈代谢和合成类固醇和肽类激素，这些激素是胎儿生长发育所必需的。妊娠时胎盘可产生雌激素、孕酮、催乳素和胎盘生长激素等多种对抗胰岛素的激素，还能分泌胰岛素酶，加速胰岛素的分解。所以Cx43 mRNA在GDM胎盘中低表达，将会导致胎盘结构和功能异常，对抗胰岛素激素分泌增多，并且加速胰岛素分解，这也是导致GDM的发病机制之一。

本实验显示GDM治疗组和正常妊娠胎盘中Cx43 mRNA表达无差异，从而得出GDM患者经过早期饮食控制、体育锻炼或是胰岛素治疗等，可以改善Cx43在其胎盘中的表达，说明提高早期诊治对GDM发展的重要性。

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（收稿日期：2014-01-06）endprint

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