STR分型检测仪器性能评价方法研究

赵颖，张涛，王守山，李彬，浦国斌，荣海博，俞丽娟

（公安部第一研究所，北京102200）

1 引言

人类基因组DNA有3×109bp，其中10%是串联重复序列，称为卫星DNA。按重复片段的长短，又可分为大卫星、中卫星、小卫星和微卫星序列。其中重复片段为2～7bp组成的称为微卫星，又称为短串联重复序列（Short Tandem Repeat，简称STR）[1]，不同人体基因组卫星DNA重复单位的数目是可变的，因此形成极其复杂的等位基因片段长度多态性[2～4]。随着分子生物学、分子遗传学和生物化学的迅猛发展，DNA分析在现代生命科学领域有着越来越重要的作用，由于它是从生物的分子-基因水平揭露生物的特性，所以具有极高的鉴定能力和广泛的应用。自1985年英国遗传学家Alee Jeffreys建立了DNA指纹技术以来，DNA技术已经成为个人识别和血缘鉴定的最有效方法，在司法鉴定领域有着举足轻重的地位。DNA分型技术历经了单位点DNA指纹（SLP）技术、以PCR为基础的可变数目串联重复序列（VNTR）与STR、小卫星变异序列（MVR）、Y-染色体单倍型测定、单核苷多态性（SNP）及线粒体DNA（mtDNA）序列测定、基因芯片技术等[5]，分子生物学逐渐渗透到法庭科学领域。刑事案件侦破、亲子鉴定、灾难身份识别等越来越依赖于DNA分析技术。目前最常用于法医DNA检验的遗传标记为STR遗传标记，这主要是由于STR分型技术原理成熟稳定，相关的技术资源丰富，世界各国数据库建设均以STR分型数据为基础。可以预见，STR分型技术在今后相当长的时间内仍是法医DNA检验的主导技术[6]。

用于STR分型检测的DNA序列分析仪及配套技术的研究不仅是多学科的交叉于综合（涉及分析化学、分子遗传学、生物化学、光学、电子与计算机学等），更是一项高科技产业，是目前乃至未来生命科学领域中的一个核心分析仪器。目前DNA分析仪主要是采用激光诱导荧光[7～9]（Laser Induced Fluorescence，LIF）方法检测毛细管电泳（Caplillary Electrophoresis，CE）。利用激光诱导荧光检测器可使毛细管电泳法的灵敏度大为增加[10]，因此，是目前应用最为广泛的检测方法。国内之前一直没有相应的产品问世，这种状况在很大程度上限制了国内DNA序列分析技术的推广应用和持续发展，针对于此类分析仪的产品性能评价也没有一个很好的方法。

本文针对此类产品的特点设计了一系列实验方法对自主研制的GA118-16A遗传分析仪的各项性能指标进行初步评价研究。实验结果表明，实验方法可行，仪器性能良好，重复性好，灵敏度高，分辨力达到单碱基分辨，满足STR分型的要求。

2 材料与方法

2.1 检测系统的模型与基本原理

GA118-16A遗传分析仪是基于激光诱导荧光毛细管电泳检测的DNA片段分析系统，如图1所示。激光器发出的激发光经过一系列二分镜、反射镜和相应的滤光片照射到毛细管中，毛细管内径中的荧光物质受激发出荧光由CCD及分光系统收集，最后经过A/D转换器由计算机采集。

图1GA118-16A遗传分析仪示意图

2.2 DNA样品与化学试剂

标准DNA样品：Gene Scan-500 LIZ（片段长度包括：50，75，100，139，150，160，200，250，300，340，350，400，450，490，500，AB公司）；主要化学试剂有：POP-4凝胶（AB公司），Hi-Di甲酰胺（AB公司），缓冲液（AB公司）。

2.3 实验方法

2.3.1迁移速度检测

将标准DNA样品配制成一定浓度的电泳上样样品，一定电泳场强下预电泳3min，采用缓冲液平衡凝胶的过程能够使胶均匀，在以后电泳中不会产生传导率变化；采用电动进样，精确控制进样时间和进样压力，消除进样量的偏差；毛细管温度从进样端至检测端保持在60℃。依次改变电泳电压：8、9、10、11、12、13、14、15KV。计算50～500 bp范围内的各个片段的迁移速度与电泳电压的关系。

2.3.2灵敏度检测

用标准DNA样品作为标准不断稀释，配制成一系列浓度梯度的样品，在固定电泳电压和电泳温度等条件下，进行电泳实验，记录相应的信噪比，并计算相应的样品浓度。

2.3.3重复性检测

将标准DNA样品配制成一定浓度的电泳上样样品，相同电泳条件下平行测定数次，比较每次出峰情况。

2.3.4分辨力检测

以PMD-18质粒为模板自设计引物，分别合成498-504bp的DNA片段，按一定比例适当混合后进行上样电泳，分析检测结果。

3 结果与讨论

3.1 迁移速度

迁移速度指带电粒子在单位时间内移动的距离。在同一电场同一介质中的粒子，如带电荷数不同或粒子大小不同，则各自电泳速度不同，因而电泳能使各粒子分开。迁移速度为：

式中，Q和γ分别是粒子的所带电荷数和有效半径，η是溶剂粘度，E为电泳时的电场强度。而电场强度为：

式中，V是电泳时的电压，L是电泳通道总长度。所以得出：

从式中可以看出，粒子在电场中运动的迁移速度，除了与电泳电压有关，还受到粒子所带电荷数和有效半径，以及溶剂粘度的影响，所以实验中采取同一标准DNA样品，同样的电泳介质以及相同的泳道长度以消除其他因素的影响。通过实验测得不同长度片段的迁移速度与电场强度的关系如图2所示，相对平均标准偏差为2%。

从图2可清楚看出迁移速度与电场强度成比较好的线性关系，此外，也可清楚看出当电场强度大于280V/cm（电泳电压大于13KV）时可完成500bp长度片段的电泳，并进行有效分离。

图2不同长度片段迁移速度与电场强度的关系

3.2 灵敏度

DNA分析仪的探测灵敏度通常是指在信噪比大于3的情况下，DNA分析仪所能检测到的毛细管内染料的最低荧光浓度。

式中，D为检出限（即灵敏度），HN为噪声峰高，ρ为样品的浓度，H为样品峰高。根据实验结果，选取样品中同一位点的最低峰为基础，记录每次的峰高，计算平行测定的平均峰高，以样品浓度对峰高作图，如图3。从图3可以看出，样品的出峰高度随着样品的浓度增大而升高；而当浓度降低到一定值时，峰值变化幅度也很小，这与仪器的信噪比有关，低于该值则无法对样品进行检测分型。根据公式（4）得出该分析仪的灵敏度为3.8×10-2ng/μL。

图3样品浓度与峰高的关系

3.3 重复性

重复性指在确定的测量条件下连续测试得到的普通原因（随即变差）变差。根据实验结果，选取任一泳道毛细管，以片段长度对出峰帧数作图，如图4。从图中可以看出，对于同一位点，每次电泳时的出峰时间基本保持一致，相对标准偏差为0.8%，仪器的重复性较好，满足STR分型要求。

3.4 分辨力

分辨力即仪器对长度相近的DNA片段的区分能力。其单位为DNA片段长度：碱基对（bp）。通过琼脂糖凝胶平板电泳对合成的片段进行纯度检测，如图5所示；并通过毛细管电泳对单个片段的实际片段长度进行检测（如图6），实验结果表明所合成DNA片段均为质量和纯度较高的长片段DNA链。

图5不同长度片段琼脂糖凝胶平板电泳

对合成的片段进行适当浓度混合，采取进样电压3KV，进样时间10s，电泳分离电压为15KV在自行研制的118-16A遗传分析仪上进行电泳，所得电泳图谱如图7所示。

在图7中可以清楚地看出，在片段长度为500bp时，2个相差1个bp的条带也可以很好的分离。因此通过该方法可以实现对DNA分析仪单碱基分辨能力的检测。

4 结论

以Gene Scan-500 LIZ作为标准DNA样品对GA118-16A遗传分析仪进行初步性能评价，通过设计的实验方案，对仪器性能进行检测，其上样检测灵敏度达到3.8×10-2ng/μL，同时可实现单碱基分辨，重复性较高。检测结果表明，设计的实验方法能够很好评价GA118-16A遗传分析仪相应性能指标。

图6498-501 bp DNA片段

图7自设计DNA片段电泳分离图

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