端粒酶hTERT反义核酸对TRAIL诱导的氟他胺耐受型前列腺癌LNCaP细胞凋亡作用的研究

高晓东陈一戎

1. 甘肃省中医院血液净化中心 （兰州 730050）; 2. 甘肃省人民医院

端粒酶hTERT反义核酸对TRAIL诱导的氟他胺耐受型前列腺癌LNCaP细胞凋亡作用的研究

高晓东1陈一戎2

1. 甘肃省中医院血液净化中心 （兰州 730050）; 2. 甘肃省人民医院

目的探讨端粒酶（hTERT）基因的两端部分硫代修饰反义核酸（AS PS-ODN）抑制氟他胺耐受型前列腺癌细胞LNCaP端粒酶活性后，肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）对LNCaP细胞凋亡的增敏作用。方法采用台盼蓝观察hTERTAS PS-ODN与TRAIL共同作用对雄激素非依赖型前列腺癌细胞LNCaP生长活力的影响；倒置显微镜观察凋亡细胞的形态变化；通过双标流式细胞仪测定凋亡细胞的百分率。结果hTERTAS PS-ODN作用于LNCaP细胞后加入TRAIL100ng/mL作用48h，LNCAP细胞的抑制率与对照组、正义核酸（S PS-ODN）组、AS PS-ODN组、TRAIL组及S PS-ODN+ TRAIL组相比有统计学差异（P＜0.01）。hTERTAS PS-ODN作用于LNCAP细胞后加入TRAIL作用48h，细胞出现典型的凋亡形态变化。hTERTAS PS-ODN作用于LNCaP细胞后加入100ng/mL TRAIL作用48h, 凋亡细胞的百分率分别与对照组、S PS-ODN组、AS PS-ODN组、TRAIL组及S PS-ODN+TRAIL组相比有显著性差异（P＜0.05）。结论hTERT基因反义核酸对TRAIL诱导的氟他胺耐受型前列腺癌细胞LNCaP凋亡有增敏作用。

端粒, 末端转移酶; 寡核苷酸类, 反义; 前列腺肿瘤; 细胞凋亡

前列腺癌是男性泌尿系最常发生的肿瘤,在美国其发病率在肿瘤患者中占第一位，死亡率占第二位[1]。我国尚无前列腺癌发病率、死亡率的精确统计资料，虽远不及欧美多，但随着人们生活水平的提

高和人群普查的开展，发病率逐年提高，而且初诊时已有30%～50%的前列腺癌患者发生了转移[2]。研究表明[3]，前列腺癌细胞属于雄激素依赖性细胞，通过抑制人体睾丸细胞产生的90%的雄激素以及肾上腺组织产生的10%的雄激素，前列腺癌细胞生长速度变缓，出现惰性生长的现象，甚至出现前列腺癌转移灶萎缩的情况，治疗效果良好。随着抗雄药物的治疗，前列腺癌细胞会由雄激素依赖性转化为雄激素非依赖型，抗雄药物治疗会逐渐失去作用。而对于雄激素非依赖型前列腺癌的治疗，目前临床上没有一个行之有效的治疗方法，是临床上最棘手的问题之一。研究表明[4]，人类端粒酶主要在肿瘤组织中表达，而在正常组织及良性肿瘤中，除了一些具有高度再生潜力和生殖细胞组织外，几乎不表达，表明端粒酶激活与肿瘤发生过程关系密切。现已证明端粒酶催化亚单位（hTERT）基因mRNA与端粒酶活性表达一致，其上游表达对端粒酶活性表达起重要作用，被认为是端粒酶活性表达的限速因子[5]。近年来有研究表明，雄激素可以调节前列腺癌细胞的端粒酶活性。雄激素阻断会导致前列腺癌细胞端粒酶限速因子hTERT基因的表达活性受到抑制伴有癌细胞端粒酶活性的降低[6]。但是端粒酶活性抑制剂只能降低肿瘤细胞端粒酶活性，并不影响其增殖。从肿瘤细胞端粒酶活性降低到其增殖受到抑制这一阶段是端粒酶活性抑制剂应用的主要障碍。因此，将端粒酶活性抑制剂和常规的放疗、化疗、免疫治疗结合起来，将有效的提高对肿瘤细胞凋亡的作用[7]。肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）可以诱导肿瘤细胞的凋亡而不影响正常细胞，因而成为目前抗肿瘤研究的热点[8]。本实验通过研究hTERT基因的两端部分硫代修饰反义核酸（AS PS-ODN）对氟他胺耐受型前列腺癌细胞LNCaP端粒酶活性的影响，探讨端粒酶活性抑制对 TRAIL诱导氟他胺耐受型（雄激素非依赖型）前列腺癌细胞LNCaP凋亡的增敏作用，为氟他胺耐受型前列腺癌治疗寻找新的途径。

材料和方法

一、材料

（一）主要试剂

RPMI 1640培养粉为北京天为时代科技有限公司产品，胎小牛血清为兰州民海生物制品公司产品，台盼蓝为兰州百奥生物制品公司产品，TRAIL为武汉博士德生物制品公司产品。Annexin-V-FITC凋亡检测试剂盒为北京天为时代科技有限公司产品。

（二）引物合成

根据hTERT基因mRNA的序列分析，设计出互补于起始密码子的反义片段共20个碱基长度作用的靶序列。hTERTAS PS-ODN的序列为5'-GGAGCGCGCG GCATCGCGGG-3'，S PS-ODN的序列为5'-CCCGCG ATGCCGCGCGCTCC-3'，每条链进行两端各3个碱基硫代修饰，由北京赛百胜生物制品公司合成，纯化，分装。

（三）细胞培养

LNCaP细胞株由本院泌尿研究所惠赠。采用含10%胎小牛血清（60℃灭活3 min），100U/mL青霉素，100U/mL链霉素的RPMI-1640培养液，在37℃，5%CO2饱和湿度条件下培养。LNCaP细胞含10%FBS的RPMI1640培养液中氟他胺用无水乙醇溶解后加入磷酸盐缓冲液（PBS，常规培养于pH7.2）至氟他胺终浓度为10-4mol/L储存。LNCaP加入氟他胺至终浓度为10-7mol/L后连续培养80代，使之成为氟他胺耐受前列腺癌细胞LNCaP-f u，实验选用对数生长期细胞。

二、方法

（一）台盼蓝拒染法检测细胞活力

实验分为6组：AS PS-ODN组、正义核酸（S PSODN组）、空白对照组、TRAIL组、TRAIL+ S PSODN组、TRAIL+ AS PS-ODN组。采用24孔培养板，每组接种3孔，每孔接种1×105细胞。第一天加入ODN 10μmol/L，24h后加入100ng/mL TRAIL，空白对照组加入等量培养液。加入TRAIL后24、48、72、96h采用台盼蓝拒染法检测LNCaP细胞的活力。

（二）细胞凋亡的形态学观察

置不同作用时间后的细胞于倒置显微镜下观察细胞的形态学变化。

（三）流式细胞仪测定凋亡细胞的百分率

调整细胞待测密度为1×105个/mL，取1mL细胞，冷PBS洗2次（3.38×103g4℃ 离心10 min），细胞悬浮于200μl结合缓冲液中。加入10μl Annexin-VFITC 和5μl的PI，避光室温反应15 min。加入300 μl结合缓冲液，立即上机检测。

三、统计学分析

结 果

一、台盼蓝拒染法检测hTERTAS PS-ODN与TRAIL联合作用对LNCaP细胞活力的影响

hTERTAS PS-ODN作用于LNCaP细胞24h后加入TRAIL100ng/mL共同作用48h，LNCaP细胞抑制率与AS PS-ODN组，S PS-ODN组，空白对照组，TRAIL组，TRAIL+ S PS-ODN组相比，有显著性差异（P＜0.01）（见图1）。

图1hTERT反义核酸与100ng/mL TRAIL联合作用48h对LNCaP细胞活力的影响

二、细胞凋亡形态学观察

hTERTAS PS-ODN作用于LNCaP细胞24h后加入100ng/mL TRAIL共同作用48h，见凋亡细胞明显增多，呈现为细胞缩小、染色质凝集、核固缩并断裂形成数个大小不等的圆形颗粒，并释放到细胞外形成凋亡小体（见图2）。

三、流式细胞仪测定凋亡细胞的百分率

hTERTAS PS-ODN与100ng/mL TRAIL联合作用48h，T24细胞凋亡百分率为36.1%，hTERTS PSODN与100ng/mL TRAIL联合作用48h，T24细胞凋亡百分率为11.2%，100ng/mL TRAIL单独作用48h，T24细胞凋亡百分率为8.25%，hTERTAS PS-ODN作用组T24细胞凋亡百分率为2.18%，hTERTS PS-ODN作用组T24细胞凋亡百分率为2.0%，对照组T24细胞凋亡百分率为2.0%，hTERTAS PS-ODN与TRAIL联合作用48h，T24细胞凋亡百分率与单用TRAIL作用组，hTERTS PS-ODN与TRAIL联合作用组，hTERTAS PS-ODN，hTERTS PS-ODN作用组及对照组进行比较有统计学意义（P＜0.05）。单用TRAIL作用组与hTERTS PS-ODN与TRAIL联合作用组比较两者差异无统计学意义（P＞0.05），见图3。

讨 论

文献报道[9]，端粒酶hTERT在各种癌细胞株及肿瘤组织中，表现出高水平的表达，与本实验结果相符。近年来有研究表明，雄激素可以调节前列腺癌细胞的端粒酶活性，雄激素阻断会导致前列腺癌细胞端粒酶限速因子hTERT基因的表达活性受到抑制伴有癌细胞端粒酶活性的降低[6]。为雄激素非依赖型前列腺癌治疗提供了新的治疗方法。

反义技术的基本原理就是根据碱基互补原则，用人工合成或生物体表达的特定互补的DNA或RNA片段（反义核酸）以抑制或封闭专一靶基因表达的技术。本实验采用两端部分硫代修饰反义核酸。硫代是指硫元素代替硫酸基团自由氧，是目前反义核酸应用研究最多的一种修饰，可以增强反义核酸的稳定性，提高反义核酸对核酸酶的耐受性，使其药物半衰期增加10倍，同时增强反义核酸对肿瘤细胞的亲核性，从而使反义核酸更容易进入肿瘤细胞核内发挥其抗肿瘤作用。

图2hTERTAS PS-ODN作用于LNCaP细胞24h加入TRAIL共同作用48h，倒置显微镜下观察细胞的形态

图3hTERT反义核酸与TRAIL100ng/mL联合作用48h，LNCaP细胞凋亡百分率

本实验结果表明，LNCaP细胞经过hTERTAS PS-ODN与TRAIL联合作用，细胞活力明显受到抑制，出现了细胞凋亡的形态学改变，呈现为细胞缩小，染色质凝集，核固缩并出现凋亡小体，同时，LNCaP细胞凋亡百分率明显增高。这与文献报道的有关反义核酸作用的研究一致[10]。

有研究表明，TRAIL是肿瘤坏死因子（TNF）细胞因子家族的新成员，和TNF、凋亡相关因子配体（FasL）一样，TRAIL也是通过与细胞膜上的相应的死亡受体（DR4, DR5）结合，激活Caspase通路，传递和放大凋亡信号，从而诱导靶细胞发生快速、大量、高效的凋亡反应[11]。TRAIL与其受体DR4,DR5特异性结合激活信号转导系统，启动凋亡程序的进行[12]。DR4,DR5同样是一种促进细胞凋亡的基因，可以合成执行细胞凋亡的酶：核酸内切酶（DNase）和凋亡蛋白酶（caspase）。前者导致肿瘤细胞染色体DNA 片段化，后者水解细胞的蛋白质结构，导致细胞的全面解体[13]。抑制hTERT表达后，肿瘤细胞失去了DNA修复能力，使染色体片段化，同时削弱了肿瘤细胞对DNA损伤的反应[14]，因而加速了TRAIL对肿瘤细胞的凋亡作用。

总之，hTERT AS PS-ODN抑制了端粒酶hTERT表达可以增加LNCaP细胞对TRAIL诱导凋亡的敏感性。采用端粒酶活性抑制剂结合肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体治疗氟他胺耐受型前列腺癌具有良好应用前景。

1 Jemal A, Siegel R,Ward E,et al.Cancer statistics.CA Cancer J Clin2009; 59(4): 225-249

2 Sim HG, Cheng CW. Changing demography of prostate cancer in Asia.Eur J Cancer2005; 41(6): 834-845

3 Hara T, Migazakin J, Araki H,et al. Novel mutations of androgen reception-A possible mechanism of bicalutamide withdrawal syndrome.Cancer Res2003; 63(1): 149-153

4 Feng J, Funk WD, Wang SS,et al. The RNA component of human telomerase.Science1995; 269(5228): 1236-1241

5 Guo C, Armbruster BN, Price DT. In vivo regulation of hTERT expression and telomerase activity by androgen.J Urol2003; 21(2 Pt 1): 615-618

6 Denmeade SR, Isaacs JT. Development of prostate cancer treatment: a good news.Prostate2004; 58(3): 211-224

7 Biroccio A, Leonetti C. Telomerase as a new target for the treatment of hormone-refractory prostate cancer.Endocr Relat Cancer 2004; 11(3): 407-421

8 Aggarwal BB, Bhardwaj U, Takada Y. Regulation of TRAIL induced apoptosis by ectopic expression of antiapoptotic factors.Vitam Horm2004; 67: 453-483

9 Nakayama J, Tahara H, Tahara E. Telomerase activation by hTERT in human normal f broblasts and hepatocellular carcinomas.Nat Genet1998; 3(4): 65-68

10 Yuan Z, Mei HD. Inhibition of telomerase activity with hTERT antisense increases the effect of CDDP-induced apoptosis in myeloid leukemia.Hematol J2002; 3: 201-205

11 Lane D, Cartier A, L'Esperance S,et al. Differential induction of apoptosis by tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand in human ovarian carcinoma cells.Gynecol Oncol2004; 93(3): 594-604

12 Wu XX, Kakehi Y, Mizutani Y,et al.Enhancement of TRAIL/Apo2L mediated apoptosis by adriamycin through inducing DR4 and DR5 in renal cell carcinoma cells.Int J Cancer2003, 104(4): 409-417

13 钦宪, 何丽娅, 李平法. 医学分子生物学. 郑州: 郑州大学出版社, 2003: 105-116

14 Msutomi K, Possemato R, Wong JM,et al.The telomerase reverse transcriptase regulates chromatin state and DNA damage responses.Proc Natl Acad Sci U S A2005; 102 (23): 8222-8227

（2014-01-10收稿）

Effects of telomerase inhibition with hTERT antisense on TRAIL-induced apoptosis in flutamide insensitive prostate cancer cells (LNCaP)

Gao Xiaodong1, Chen Yirong2
1. The Traditional Chinese Medicine Hospital of Gansu Province, Lanzhou 730050, China;
2. The People Hospital of Gansu Province

ObjectiveTo investigated the effects of telomerase inhibition withhTERTantisense on TRAIL-induced apoptosis in flutamide insensitive prostate cancer cells (LNCaP).MethodsAntisense phosphorothioate oligodeoxynucleotide (AS PS-ODN) was synthesized and purified. Cell viability was determined by MTT assay.Cell apoptosis was observed by morphological method and measured by f owcytometry.ResultsAS PS-ODN could signif cantly increase TRAIL-induced apoptosis in LNCaP cells.ConclusionInhibition of telomerase withhTERTantisense can enhance TRAIL-induced apoptosis in f utamide insensitive prostate cancer cells (LNCaP).

telomerase; oligonucleotides, antisense; prostatic neoplasms; apoptosis

10.3969/j.issn.1008-0848.2014.05.005

R 737.25