Y染色体长度异常与精子凋亡和生殖结局相关性研究*

彭 亮吴 昕马 强贾韶彤景万红阳清虎刘春莲**

1.宁夏医科大学基础医学院实验中心（银川 750004）;

2.宁夏医科大学总医院生殖医学中心; 3. 宁夏医科大学生育力保持教育部重点实验室

Y染色体长度异常与精子凋亡和生殖结局相关性研究*

彭 亮1,3吴 昕2,3马 强1,3贾韶彤2,3景万红2,3阳清虎2,3刘春莲2,3**

1.宁夏医科大学基础医学院实验中心（银川 750004）;

2.宁夏医科大学总医院生殖医学中心; 3. 宁夏医科大学生育力保持教育部重点实验室

目的探讨辅助生殖技术过程中，Y染色体长度异常的影响机制，分析Y染色体长度异常与精子凋亡和生殖结局的相关性。方法将研究对象分为A组（大Y组），B组（小Y组）以及C组（对照组），分别为28例、16例及30例。采用磷脂结合蛋白V（Annexin V）/碘化丙啶（Propidium iodide, PI）精子染色，通过流式细胞仪（FCM）检测精子亚群所占的比例。结果（1）男性年龄、精液量、密度、活率以及AN-/PI-在3组中分布无差异；B组与C组相比，AN+/PI-和AN/PI+有统计学意义（P＜0.05）；（2）以AN+/PI-值为20%分组，A，B，C组受精率、临床妊娠率以及早期胚胎丢失率在2组中均无统计学差异；但AN+/PI-≥20%，B组与C组相比，临床妊娠率有统计学差异（P＜0.05）。结论 大Y染色体与精子凋亡无明显相关性，小Y可能与精子凋亡相关并影响生殖结局。

染色体, 人, Y; 精子; 细胞凋亡; 生殖结局

Y染色体长度异常包括大Y和小Y，是最为常见的男性染色体变异。目前研究的热点集中在其与临床表现的相关性[1,2]，但Y染色体长度变异是否影响到精子遗传物质，进而出现相应的临床症状，目前尚无此方面的相关研究。本研究利用磷脂结合蛋白V（Annexin V）/碘化丙啶（PI ）双染法对在我中心接受体外受精-胚胎培养（IVF-ET）技术的Y染色体长度异常患者检测其精子DNA损伤程度，分析Y染色体长度变异与精子DNA损伤的相关性。

对象和方法

一、研究对象

选择2011年11月至2012年9月在本院生殖医学中心就诊的74例男性患者，其中大Y28 例，小Y 16例，染色体正常对照30例， 排除标准：（1）排除多囊卵巢综合征、子宫内膜异位症、卵巢功能低下等干扰因素；（2）每名女性取卵数≤5枚；（3）无精子症。

二、方法

（一）精液常规及形态学检查

研究对象禁欲2～5d，通过手淫法收集精液于无菌取精杯后，置37℃下完全液化，遵照WHO（5版）技术规范，利用计算机辅助精子动态图像检测系统（Computer-assisted semen analysis, CASA）检测。取5～10μl精液，采用拉薄制片法涂片，利用巴氏染色方法行精液形态学分析。

（二）染色体核型分析

采用外周血淋巴细胞培养，常规制备染色体标本，G显带分析。分别以Y染色体≥18号染色体，Y染色体≤21号染色体作为大Y和小Y染色体的标准。

（三） IVF /ICSI-ET 助孕

严格按照宁夏医科大学总医院生殖医学中心临床操作手册执行。包括控制性超排卵、采卵、体外受精与移植过程，移植后14 d 行血人绒毛膜促性腺激素（Human chorionic gonadotropin，HCG）检查，阳性者在4 周后行B 超检测，孕囊存在为临床妊娠。

（四）Annexin V/PI 双染法

按照 Annexin V-FITC/PI细胞凋亡试剂盒（凯基生物科技发展有限公司，南京）操作说明进行。将精子悬液用PBS洗涤细胞2次（2000rpm离心5min）收集1～5×105细胞, 加入500μl的Bingding Buffer悬浮细胞，加入5 μl Annexin V-FITC混匀后，再加入5μl PI溶液混匀，避光孵育15 min。

（五）FCM检测

流式细胞仪器（Flow Cytometer，FCM）检测，激发波长Ex=488nm，发射波长Em=530nm。样本均获取10 000 个精子, 数据用Cell Quest软件分析。

三、统计学分析

应用SPSS 16.0 统计软件，组间均数比较偏态分布采用秩和检验，正态分布采用t检验，组间率的比较采用卡方检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

本项研究得到了本院生殖医学伦理委员会的批准。

结 果

一、Annexin V/PI双染后经FCM检测质膜PS外翻结果

由图1可见，左下象限是活的、未凋亡精子，为Annexin及PI阴性（AN-/PI-）；右下象限是PS外翻精子，为Annexin阳性、PI阴性（AN+/ PI-）；右上/左上象限为坏死精子PI阳性（AN/PI+）。

图1 Annexin V/PI双染后经FCM检测质膜PS外翻结果

二、3组Annexin V/PI双染法精子凋亡情况与精液常规比较

将研究对象分为A组（大Y组），B组（小Y组）及C组（对照组），分别为28例、16例及30例。 三组Annexin V/PI双染法精子凋亡情况与精液常规比较见表1。

表1 3组Annexin V/PI双染法精子凋亡情况与精液常规比较

三、精子DNA损伤与IVF-ET妊娠结局的相关性

以AN+/PI-值为20%分界，对比三组的受精率、临床妊娠率以及早期胚胎丢失率，见表2。

表2 以AN+/PI-值为20%分界三组妊娠结局的比较

讨 论

Y染色体长度异常是由异染色质区的DNA过多重复或缺失所致，1978年Nielsen报道Yq+（大Y）与流产呈正相关[3]，其临床表现差异较大，评价指标亦局限于精液常规指标和形态学分析，而大Y 和小Y是否会影响到精子 DNA损伤进而出现临床症状尚无相关报道。Oleszczuk等以精子碎片化指数（DFI）为30%分界，检测个体间的DFI波动情况，证实85%变化在同一个区间内[4]。因此检测DNA损伤情况具有绝对的稳定性。DNA损伤是由于精子染色质包装异常、高活性氧反应以及凋亡3大因素造成[5]。

本研究采用Annexin V/PI双染经FCM检测，将精子分为正常精子，早期凋亡精子和坏死精子。Annexin V是Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，与PS 有高度亲和力，早期凋亡精子存在质膜PS外翻，Annexin V 能与其结合，这时膜尚未破裂，PI染料不能进入细胞内部，为PI-；活的、未凋亡的精子为Annexin V-/PI-； 坏死精子或者处理过程中质膜破坏的精子为PI+。

本研究数据显示3组精液量、密度和活力没有统计学差异，小Y组AN+/PI-所占比例高于大Y组和对照组中，具有统计学差异（P＜0.05），进一步分析发现小Y组中有2例精液常规参数和形态均正常，但AN+/ PI-均高于30%。Jonathan等对Y染色体长臂缺失的小鼠研究，发现其与异常染色质包装和精子DNA损伤呈正相关[6]。本研究通过Annexin V-/PI-值为20%进行分组，比较受精率、临床妊娠率以及胚胎丢失率在3组中的分布差异。AN+/PI-值≥20%，小Y组与对照组相比，临床妊娠率具有统计学差异（P＜0.05）。Lynne等对16项研究（2969对夫妇）进行Meta分析，DNA损伤与流产存在明显的正相关（RR= 2.16，P＜0.00）[7]。DNA精子损伤可能并不影响受精过程，但阻止囊胚形成或胚胎顺利发育，在囊胚发育时期，胚胎基因组激活，转录活性开始，父性效应在胚胎发育到4～8细胞期发挥作用，因此在这一时期，父性DNA诱导的改变很明显，损害胚胎的发育。在IVF中，在高DNA损伤和低DNA损伤的患者中，临床妊娠率没有区别，因为这是一种自然地精子选择过程，精子形态异常，活力差和DNA损伤，有很低的受精率。这种观点被之前的研究证实，透明带可能有识别精子异常物质损伤的功能。一项对28个精子DNA损伤与IVF/ICSI相关性研究综述表明，DNA损伤对ICSI妊娠结局的影响高于IVF[8]。本研究中AN+/PI-≥20%组中，3组早期胚胎流产率均高于AN+/PI-＜20%组，但无统计学差异，这可能与研究样本例数有关。Bronet等研究认为精子DNA损伤指数与胚胎非整倍体无相关性，在习惯性流产和种植失败的患者，不同的监测方式得到的结果不同[9]。

今后的研究将不断收集染色体长度异常病例资料，更加客观的评价其临床效应，同时有必要从分子水平进一步研究DNA损伤的机制，和抗氧化治疗的潜在效果，为治疗男性不育症以及不明原因不育提供诊断和治疗依据。

1 Minocherhomji S,Athalye AS, Madon PF,et al.A casecontrol study identifying chromosomal polymorphic variations as forms of epigenetic alterations associated with the infertility phenotype.Fertil Steril2009; 92(1): 88-95

2 Sakkas D, Alvarez JG. Sperm DNA fragmentation: mechanisms of origin, impact on reproductive outcome, and analysis.Fertil Steril2010; 93(4): 1027-1036.

3 Nielsen J. Chromosome (Yq+) and increased risk of abortion.Clin Genet1978; 13(5): 415-416

4 Oleszczuk K, Giwercman A, Bungum M. Intra-individualvariation of the sperm chromatin structure assay DNA fragmentation index in men from infertile couples.Hum Reprod2011; 26(12): 3244-3248

5 Aitken RJ, de Iuliis GN. On the possible origins of DNA damage in human spermatozoa.Mol Hum Rep2010; 16(1): 3-13

6 Lynne R, Ioannis DG, Sarah JC,et al. Def ciency of the multi-copy mouse Y gene Sly causes sperm DNA damage and abnormal chromatin packaging.J Cell Sci2013; 126(Pt 3): 803-813

7 Lynne R, Ioannis DG, Sarah JC,et al. The effect of sperm DNA fragmentation on miscarriage rates: a systematic review and meta-analysis.Hum Reprod2012; 27(10): 2908-2917

8 Zini A, Jamal W, Cowan L,et al.Is sperm DNA damage associated with IVF embryo quality? A systematic review.J Assist Reprod Genet2011; 28(5): 391-397

9 Bronet F, Martínez E, Gaytán M,et al. Sperm DNA fragmentation index does not correlate with the sperm or embryo aneuploidy rate in recurrent miscarriage or implantation failure patients.Hum Reprod2012; 27(7): 1922 -1929

（2013-12-12收稿）

The relationship of abnormal lengthy Y chromosome with sperm apoptosis and reproductive outcome*

Peng Liang1,3, Wu Xin2,3, Ma Qiang1,3, Jia Shaotong2,3, Jing Wanhong2,3, Yang Qinghu2,3, Liu Chunlian2,3**
1. Experiment Center of Basic Medical College, Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, China; 2.Center of Reproductive Medicine, General Hospital of Ningxia Medical University; 3.Key Laboratory of Fertility
Maintenance,Ministry of Education,Ningxia Medical University

Liu Chunlian, E-mail: liucl1981@aliyun.com

ObjectiveTo explore the effects of abnormal lengthy Y chromosome on reproductive outcome and sperm apotosis and analyze their relationship.MethodsThe object of study were divided into three groups including Group A (big Y chromosome), Group B (small Y chromosome) and Group C (controls). DNA fragmentation was stained by Annexin V/PI assay,the results were analyze by f ow cytometry (FCM)to determine the ratio of AN-/PI-, AN+/ PI-and AN/PI+. Results (1)No signif cant differences were found in male age ,sperm volume, parameters and AN-/PI- among three groups;there were signif cant difference in AN+/PI-and AN/PI+between Group B and Goup C (P<0.05). (2)There was no changes in fertilization rate, clinical pregnancy rate and early pregnancy loss rate among three groups; however, for AN+/PI-≥20% ,implantation rate was signif cantly differece between group B and group C (P<0.05).ConclusionBig Y chromosome had no correlation with sperm apoptosis, while small Y chromosome may be related with sperm apoptosis and reproductive outcome.

Chromosomes, Human, Y; spermatozoa; apoptosis; reproductive outcome

10.3969/j.issn.1008-0848.2014.04.007

R 321-33

资助: 宁夏自然科学基金面上项目（NZ11281）；宁夏医科大学面上科研项目（XQ2011020）

**通讯作者, E-mail: liucl1981@aliyun.com