针刺治疗慢性应激抑郁型大鼠的机制研究

刘明菲，燕 平，乔瑞瑞，金晓飞，王海军，闫丽萍

(山西中医学院，山西太原 030024)

当今社会在“快餐式”的飞速发展中，竞争压力越来越大，抑郁症的发病率呈上升趋势，抑郁症以兴致低落和自我体验为核心症状［1］。目前抑郁症机制尚不明确，众说纷纭，广为大家所探讨的机制其一是下丘脑—垂体—肾上腺轴(HPA轴)［2～4］功能失调的研究，其二是有关细胞外信号通路系统(ERK通路)功能失调的探讨［5］。结合之前所研究的针灸治疗抑郁症最佳组方，本文旨以此为基础，针对以上两个机制研究，讨论针灸治疗抑郁症最佳组方对慢性应激抑郁型大鼠的治疗机制。

1 材料

1.1 实验动物

清洁级SD雄性大鼠30只，体重(250±20)g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。

1.2 试剂与仪器

ERK1免疫组化试剂盒购自山西吉泰和宁科技有限公司。FA-1004型精密电子天平，上海天平仪器厂。

2 实验方法

2.1 分组

将30只大鼠随机分为3组。分别为空白组(n=10)，模型组(n=10)和针刺治疗“解郁方”组(百会+神门+太冲)。

2.2 模型制备

采用李艺等［6］、王雀良等［7］实验造模方法并加以改良。本实验采用21 d不同刺激。应激源包括:冷水游泳(4 ℃，5 min)、禁水(24 h)、禁食(24 h)、昼夜颠倒(24 h)、热烘(45℃，5 min)、束缚 (3 h)，夹尾(3 min)。以7 d为1个周期，每天随机安排其中1种，单笼饲养。

2.3 针刺处理

造模开始后就对针刺治疗组进行治疗。选用华佗牌15 mm针灸针进行针刺，连接到SDZⅡ型HANS电刺激仪。电针频率为2 Hz，刺激强度不超过2 mA［8］，共电针20 min。每日1次，于应激造模前1 h针刺，连续治疗3周。模型组抓取、固定，但不做针刺，其他处理同针刺组。空白组群养不予任何处理。

2.4 观察指标

2.4.1 肾上腺指数 大鼠按剂量10 g/L腹腔注射20%的乌拉坦，麻醉后断头，手术剪解剖腹腔，完整取出肾上腺，用眼科镊剔除结缔组织和脂肪，用1 mL注射器抽取9%氯化钠注射液1 mL，将肾上腺残留的血水冲净，用定性滤纸将其吸干后，称取肾上腺质量，计算肾上腺指数。计算公式为:腺体指数=腺体质量(mg)/体重(100g)。

2.4.2 ERK1免疫组化阳性细胞计数 方法同上，断头后，为方便解剖，冰上头颅，迅速游离左侧完整海马组织，取出左侧海马组织，标本经10%中性福尔马林固定48 h，常规石蜡包埋，切片以海马为中心做冠状面切片，厚度50 μm。免疫组化SABC法染色。

2.4.3 SABC法染色 将切片置于切片架上，于60℃恒温烤箱中烤1 h;切片放入盛有二甲苯的容器中脱蜡3次，10 min/次;切片经下行酒精水化，无水乙醇5 min，95% 乙醇 2 次(2 min/次)，85% 乙醇2 min，75%乙醇2 min，自来水冲洗 3次，双氧水洗 2次(2 min/次);水浴锅加热切片至100℃，室温自然冷却，自来水冲洗，双氧水及 TBS分别洗涤 2次(2 min/次);滴加封闭缓冲液，ERK1一抗孵育切片，TBS洗涤，滴加封闭缓冲液，37℃湿盒孵育10 min;30 min湿盒孵育生物素化羊抗兔IgG(1∶400);TBS洗涤，Tween 20封闭20 min，室温下孵育HRP-SA复合物(1∶150)，TBS洗涤5 min，2次，DAB 显色液加强染色;脱水、透明、封片，阴性对照用PBS替代一抗。光镜下观察并照相。

2.5 结果判定

ERK1阳性定位于细胞质，利用Image Pro Plus6.0多功能真彩色细胞图像分析管理系统，每张切片(200倍光镜下)选择4个不重叠的视野，图像分析软件进行图像采集和处理，选取海马两侧齿状回部位，ERK1阳性染色定位于细胞胞浆，用单位面积阳性细胞记数和总细胞数的百分比表示该成分的相对含量，取其平均值。

3 统计学方法

实验后的统计数据应用SPSS 17.0进行统计学处理，以均数±标准差±s)表示，组间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异具统计学意义。

4 结果

4.1 肾上腺指数

对抑郁模型大鼠腺体重量的影响，与空白组大鼠相比，均出现了显著性变化(P＜0.05)，模型组及治疗组均出现肾上腺指数升高。与模型组相比，治疗组与其存在统计学差异(P＜0.05)。结果提示针刺“解郁方”治疗组对抑郁模型所致肾上腺指数的上升具有一定的抑制作用(见表1)。

4.2 ERK1阳性细胞相对含量

空白组的ERK1阳性神经元数目的相对含量较治疗组无统计学差异(P＞0.05)，较模型组有统计学差异(P＜0.05)。模型组的ERK1阳性神经元数目的相对含量较治疗组有统计学差异(P＜0.05)。空白对照为阴性反应。结果提示抑郁症能抑制ERK通路调节，针刺治疗抑郁症能有效兴奋其通路恢复正常(见表2)。光镜下可见ERK1免疫组织化学的阳性细胞位于海马区，主要集中于CA1、CA3区锥体细胞，其阳性反应存在于细胞胞浆中，细胞胞核不染色(见图1)。

表1 针刺对各组大鼠腺体质量的影响Table 1 Effect of the Rats＇Adrenal Mass in Acupuncture Groups

表2 各组大鼠海马ERK1相对含量比较 个/HPTable 2 Comparison of Relative Contents of Erk1 in Each Groups one/HP

图1 各组海马齿状回ERK1的表达，免疫组化SABC法Fig 1 Expression of Hippocampal Pentate Gyrus ERK1and Immunolistochemical SABC Method

5 讨论

抑郁症的生理病理机制十分复杂。目前认为，抑郁症是由多种因素相互作用的结果，本文就该问题进行实验以探寻针刺治疗抑郁症机制，通过腺体质量研究其与下丘脑—垂体—肾上腺(HPA)轴的关联，通过海马组织ERK1的阳性细胞相对含量发现针刺治疗抑郁症与ERK通路关系。

Amsterdam等［9］文献研究表明，与非抑郁人群相比，抑郁症患者的肾上腺形态增大;HPA轴功能活跃，内源性ACTH的慢性刺激导致肾上腺肥大。本文结果提示抑郁型大鼠肾上腺增重、肥大，虽尚不能达到正常大鼠水平，但模型组大鼠肾上腺质量有所改观。

海马是边缘系统重要组成部分之一，参与情绪、记忆和学习、免疫、行为等的调节，它的损伤在各种应激所致疾患中起至关重要的作用。因此，在抑郁症的机制研究中，探讨应激对海马的影响是极为重要的。应激能破坏神经元损伤与再生之间的平衡，颗粒细胞减少，CA3锥形神经元萎缩及数目的减少，海马体积下降，功能受损，最终出现抑郁症的临床变现。ERK是一个重要的细胞内信号分子，调控基因表达。ERK1可诱发脑内神经元的快速变化，慢性应激可以一定程度上引起大鼠脑内ERK通路表达抑制，而电针可以改善其抑制作用。电针可活化ERK通路上的关键指标ERK，故而对下游产生影响而发挥抗凋亡和抗抑郁的作用。本文研究ERK蛋白相对含量提示，电针能有效改善神经元凋亡、萎缩等现象，其效果基本达到正常大鼠水平，因此针刺能有效改善其功能，更对ERK通路有活跃功能。

［1］ 龚绍麟.抑郁症［M］.北京:人民卫生出版社，2003.

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［3］ 杜元灏，李桂平，颜 红，等.调神疏肝针法治疗抑郁的临床研究［J］.中国针灸，2005，25(3):151.

［4］ 孙冬玮，王 珑.针刺对慢性应激抑郁模型大鼠HPA轴的影响［J］.上海针灸杂志，2007，26(2):32.

［5］ 卢 峻，时宇静，费宇彤，等.电针对抑郁模型大鼠脑磷酸化cAMP反应元件结合蛋白表达的影响［J］.中国中医基础医学杂志，2006，12(5):380-382.

［6］ 李 艺，具紫勇，夏 勇，等.电针对围绝经期抑郁症模型大鼠的效应研究［J］.上海针灸杂志，2010，29(10):670-673.

［7］ 王雀良，潘集阳，刘亚平，等.抑郁症动物模型的回顾与展望［J］.广东医学，2011，32(7):932-935.

［8］ 陈华德，金灵青，娄 冉，等.百会穴电针和埋线对慢性应激抑郁模型大鼠行为学及血清CORT和ACTH的影响［J］.上海针灸杂志，2010，29(4):244-247.

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