通心络对早期糖尿病肾病大鼠肾功能及肾组织NO/eNOS表达的影响

周盛楠 高彦彬 李娇阳 邹大威 朱智耀 张娜 王馨瑶 李光超 崔方强 刘静

糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病发展过程中最常见的慢性微血管并发症之一。据世界卫生组织统计，截止2013年10月全球有3.47 亿人患有糖尿病。据统计，25%～40%的糖尿病患者伴随糖尿病肾病。在西方国家，糖尿病肾病是导致终末期肾病的主要原因［1］。由于DN 发病机制尚未完全阐明，目前尚无有效药物阻止DN 患者肾功能的进行性衰减，一旦发展至终末期肾病则需透析或肾移植治疗。因此，探求糖尿病肾病的发病机制，寻求有效的药物成为当前糖尿病学界及肾脏病学界研究的热点。临床及实验研究表明，DN 早期肾小球高灌注、高压力、高滤过状态可导致肾小球肥大，并与肾小球超微结构的改变密切相关［2-3］。引起肾小球高灌注、高压力、高滤过的机制尚未阐明，目前研究认为内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)蛋白表达增强引起的一氧化氮(nitric oxid，NO)生成增多参与DN 早期肾小球肥大及肾小球高滤过的发展过程［4］。本课题采用高脂饲料联合链脲佐菌素建立早期DN 大鼠模型，通过检测肾组织中NO 含量及eNOS 蛋白的表达，探讨中药通心络治疗糖尿病肾病的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物

SPF 级8 周龄雄性SD 大鼠40 只，体重180～220 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物合格证号:SCXK(京)2012-0001。

1.2 药品

通心络超微粉(主药为人参、赤芍、大枣、檀香、降香、水蛭、全蝎、土鳖虫、蜈蚣、蝉蜕、乳香、冰片等)，产品批号:20130108，河北以岭医药研究院有限公司;缬沙坦胶囊(商品名:代文，规格:80 mg/粒，产品批号:X1448，批准文号:国药准字H20040217，北京诺华制药有限公司)

1.3 主要试剂

Sigma 链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)，货号:SO130-1g，购自北京首医临床技术中心;柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液(0.1 M，pH=4.4，购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司);大鼠尿微量白蛋白酶联免疫试剂盒(批号:19，购自北京欣博盛生物科技有限公司);NO 检测试剂盒(批号:A012，南京建成科技有限公司);肌酐测定试剂盒(批号:4501-40-2013，上海科华生物工程有限公司);大鼠尿素氮试剂盒(批号:4217-39-2013，上海科华生物工程有限公司)。

1.4 主要仪器

电子天平(YP601N，上海精密科学仪器有限公司);血糖仪［CareSense POP GM505EA，爱科来国际商贸(上海)有限公司］;酶标仪(Multiskan MK3，Thermo Scientific);全自动生化分析仪(卓越320、330，上海科华实验系统有限公司);电泳仪(ELITE200，Wealtec Corp，USA);小型垂直电泳槽(V-GES，Wealtec Corp，USA)等。

1.5 模型建立与分组给药

本实验采用高脂饲料联合小剂量STZ 法建立DN 大鼠模型:SPF 级雄性SD 大鼠40 只，适应性喂养1 周，依据体重随机分为正常对照组10 只，予以普通饲料。造模组30 只，予以高脂饲料。4 周后所有大鼠均禁食(不禁水)12 小时后，造模组大鼠腹腔注射1% STZ 35 mg/kg(以pH 为4.2～4.4 的0.1 mol/L柠檬酸缓冲液配置)，空白组注射等剂量的柠檬酸缓冲液为对照，72 小时后经大鼠尾静脉采血测血糖，以空腹血糖大于16.7 mmol/L。将成模大鼠随机分为模型组，缬沙坦组及通心络组。次日开始给药，西药组予缬沙坦10 mg/(kg·d)灌胃，通心络组予通心络超微粉0.4 g/(kg·d)灌胃，空白组及模型组予等体积蒸馏水灌胃，连续灌胃8 周，实验过程中无大鼠死亡。

1.6 标本采集

灌胃期间，每月动态监测大鼠血糖。于治疗4周、8 周各时点，将各组大鼠置于代谢笼中收集24小时尿液并记录尿量，用于检测24 小时尿微量白蛋白排泄率(urinary albumin excretion，UAER)。于治疗4 周、8 周各时点，剪尾取血，分离血清并于-20℃冰箱保存，用于检测血肌酐、血尿素氮，并计算内生肌酐清除率。各组大鼠连续灌胃8 周，禁食12 小时，用10%水合氯醛按0.35 ml/kg 注射麻醉，取出双侧肾脏，左肾称重后置于4%多聚甲醛中固定，右肾液氮冻存。血液标本及液氮速冻后的肾组织-80℃保存备用。

1.7 观察指标及方法

(1)血糖(fasting blood glucose，FBG)，采用尾静脉取血，用CareSense POP 血糖仪及血糖试纸检测。(2)血肌酐(serum creatinine，SCr)、血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)，采用卓越全自动生化仪及相应试剂盒检测。并计算内生肌酐清除率(creatinine clearance rate，Ccr):内生肌酐清除率=尿肌酐×24 小时总尿量(按毫升计)÷血肌酐÷1440 分钟÷体质量(按克计)×100，单位为ml/(min·g/100)。(3)24 小时UAER 采用ELISA 酶联免疫学方法检测，操作步骤见试剂盒说明书。(4)肾重及体质量，采用电子天平称量，肾重指数=肾重/体质量。(5)肾组织NO 含量，采用硝酸酶还原法检测，按试剂盒说明书操作。(6)肾组织eNOS 蛋白表达，采用Western-blot 法，每组随机选取4 个样本。

1.8 统计分析

2 结果

2.1 通心络对各组大鼠FBG 的影响

经Tamhane's T2 检验，4 周及8 周大鼠血糖值，与空白组比较，模型组大鼠于治疗4 周及8 周血糖明显升高，差异具有统计学意义(P＜0.01)。与模型组比较，通心络组及缬沙坦组大鼠于治疗4 周及8 周血糖无统计学意义(P＞0.05)。通心络组与缬沙坦组比较无统计学意义(P＞0.05)，见表1。

2.2 通心络对各组大鼠UAER 的影响

经检验，治疗4 周大鼠UAER 四组间有差别(F=521.663，P=0.000)，且方差齐。经LSD 检验发现，与空白组比较，模型组大鼠UAER 显著升高，差异具有统计学意义(P＜0.01)。与模型组比较，通心络大鼠UAER 显著降低，差异具有统计学意义(P＜0.01)，缬沙坦组大鼠UAER 显著降低，差异具有统计学意义(P＜0.01)。通心络及缬沙坦组比较无统计学意义(P＞0.05)。治疗8 周大鼠UAER 四组间有差别(F=391.440，P=0.000)，且方差不齐。经Tamhane’s T2 检验发现，与空白组比较，模型组大鼠UAER 显著升高，差异具有统计学意义(P＜0.01)。与模型组比较，通心络大鼠UAER 显著降低，差异具有统计学意义(P＜0.01)，缬沙坦组大鼠UAER 显著降低，差异具有统计学意义(P＜0.05)。通心络及缬沙坦组比较无统计学意义(P＞0.05)，见表1。

表1 大鼠血糖及尿微量白蛋白比较(±s，n=10)

表1 大鼠血糖及尿微量白蛋白比较(±s，n=10)

组名 FBG (mmol/L) UAER (mg/24h)空白组4 周 5.84±0.44 0.303±0.025 8 周 5.90±0.55 0.338±0.030模型组4 周 27.01±4.77 1.890±0.159 8 周 28.00±4.67 2.577±0.171通心络组4 周 26.46±2.90 1.692±0.090 8 周 26.54±2.48 2.228±0.107缬沙坦组4 周 26.33±1.77 1.697±0.085 8 周28.53±1.48 2.230±0.253

2.3 通心络对各组大鼠SCr 的影响

经检验，治疗4 周大鼠SCr 四组间含量有差别(F=65.446，P=0.000)，且方差不齐。经Tamhane's T2 检验发现，与空白组比较，模型组大鼠SCr 显著升高，差异具有统计学意义(P＜0.01)。与模型组比较，通心络大鼠SCr 显著降低，差异具有统计学意义(P＜0.01)，缬沙坦组大鼠SCr 显著降低，差异具有统计学意义(P＜0.05)。通心络及缬沙坦组比较无统计学意义(P＞0.05)。治疗8 周大鼠SCr 四组间含量有差别(F=121.644，P=0.000)，且方差齐。经LSD 检验，与空白组比较，模型组大鼠SCr 显著升高，差异具有统计学意义(P＜0.01)。与模型组比较，通心络大鼠SCr 显著降低，差异具有统计学意义(P＜0.01)，缬沙坦组大鼠SCr 显著降低，差异具有统计学意义(P＜0.01)。通心络及缬沙坦组比较无统计学意义(P＞0.05)，见表2。

2.4 通心络对各组大鼠BUN 的影响

经检验，治疗4 周及8 周大鼠BUN 四组间含量有差别(4 周:F=74.42，P=0.000;8 周:F=177.264，P=0.000)，且方差均不齐。经Tamhane's T2 检验发现，与空白组比较，模型组大鼠BUN 显著升高，差异具有统计学意义(P＜0.01)。与模型组比较，通心络及缬沙坦组大鼠BUN 显著降低，差异具有统计学意义(P＜0.01)。通心络及缬沙坦组比较无统计学意义(P＞0.05)，见表2。

2.5 通心络对各组大鼠Ccr 的影响

经检验，治疗4 周及8 周大鼠Ccr 四组间有差别(4 周:F=36.560，P=0.000;8 周:F=106.348，P=0.000)，且方差均齐。经LSD 检验发现，与空白组比较，模型组大鼠Ccr 显著升高，差异具有统计学意义(P＜0.01)。与模型组比较，通心络组大鼠Ccr显著降低，差异具有统计学意义(P＜0.01)，缬沙坦组大鼠Ccr 显著降低，差异具有统计学意义(P＜0.05)。通心络及缬沙坦组比较无统计学意义(P＞0.05)，见表2。

表2 大鼠血肌酐、尿素氮及内生肌酐清除率比较(±s，n=10)

表2 大鼠血肌酐、尿素氮及内生肌酐清除率比较(±s，n=10)

组名 SCr(μmol/L)BUN(mmol/L)Ccr ml/(min·g/100)空白组4 周 29.60±1.84 5.41±0.67 0.777±0.108 8 周 30.10±1.67 5.28±0.70 0.789±0.073模型组4 周 40.20±2.49 9.64±0.90 1.328±0.115 8 周 46.40±2.07 12.00±0.99 1.673±0.132通心络组4 周 35.60±0.70 7.18±0.50 1.135±0.129 8 周 39.90±2.51 8.25±0.32 1.427±0.093缬沙坦组4 周 37.00±1.41 7.20±0.33 1.182±0.135 8 周40.80±1.32 8.45±0.35 1.534±0.162

2.6 通心络对各组大鼠肾重的影响

经检验，治疗8 周大鼠肾重四组间含量有差别(F=63.962，P=0.000)，且方差不齐。经Tamhane’s T2 检验发现，与空白组比较，模型组大鼠肾重显著升高，差异具有统计学意义(P＜0.01)。与模型组比较，通心络及缬沙坦组大鼠肾重显著降低，差异具有统计学意义(P＜0.05)。通心络及缬沙坦组比较无统计学意义(P＞0.05)，见表3。

2.7 通心络对各组大鼠肾重指数的影响

经检验，治疗8 周大鼠肾重指数四组间含量有差别(F=214.083，P=0.000)，且方差不齐。经Tamhane’s T2 检验，与空白组比较，模型组大鼠肾重指数显著升高，差异具有统计学意义(P＜0.01)。与模型组比较，通心络及缬沙坦组大鼠肾重指数显著降低，差异具有统计学意义(P＜0.01)。通心络及缬沙坦组比较无统计学意义(P＞0.05)，见表3。

表3 大鼠治疗8 周肾重、肾重指数比较(±s，n=10)

表3 大鼠治疗8 周肾重、肾重指数比较(±s，n=10)

组名 肾重(g) 肾重指数(×10 －3)1.23±0.07 2.32±0.09模型组 2.13±0.25 5.60±0.51通心络组 1.79±0.10 4.31±0.21缬沙坦组空白组1.82±0.09 4.48±0.20

2.8 通心络对各组大鼠肾组织NO 的影响

经检验，治疗8 周大鼠肾组织NO 含量四组间有差别(F=9.735，P=0.000)，且方差齐。经LSD检验，与空白组比较，模型组大鼠肾组织NO 含量显著升高，差异有统计学意义(P＜0.01)。与模型组比较，通心络组大鼠肾组织NO 含量显著降低，差异有统计学意义(P＜0.01)，缬沙坦组大鼠肾组织NO显著降低，差异有统计学意义(P＜0.01)。通心络及缬沙坦组比较无统计学意义(P＞0.05)，见表4。

2.9 通心络对各组大鼠肾组织eNOS 蛋白表达量的影响

经检验，治疗8 周大鼠肾组织eNOS 蛋白表达量四组间有差别(F=8.748，P=0.002)，且方差齐。经LSD 检验，与空白组比较，模型组大鼠肾组织eNOS 蛋白表达量显著升高，差异具有统计学意义(P＜0.01)。与模型组比较，通心络组大鼠肾组织eNOS 蛋白表达量显著降低，差异具有统计学意义(P＜0.01)，缬沙坦组大鼠肾组织eNOS 蛋白表达量显著降低，差异具有统计学意义(P＜0.05)。通心络及缬沙坦组比较无统计学意义(P＞0.05)。见表4。由图1可知，模型组eNOS 灰度较空白组显著增加，缬沙坦组及通心络组较模型组显著减少。

表4 大鼠治疗8 周肾组织NO 含量及eNOS 蛋白表达(±s)

表4 大鼠治疗8 周肾组织NO 含量及eNOS 蛋白表达(±s)

组名 NO (μmol/gprot，n=10) eNOS/β-actin (n=4)1.36±0.17 0.63±0.08模型组 1.99±0.42 1.37±0.06通心络组 1.55±0.17 0.83±0.30缬沙坦组空白组1.63±0.23 1.00±0.28

图1 各组大鼠肾组织eNOS 蛋白表达

3 讨论

3.1 NO 及eNOS 对早期糖尿病肾病的影响

DN 发病涉及遗传因素、糖脂代谢紊乱、血流动力学改变、氧化应激、肾间质纤维化等环节［5］。DN早期，肾小球高灌注造成的肾小球肥大是导致DN肾小球硬化的主要原因之一。内皮衍生的血管舒张因子NO 是介导DN 早期高滤过发生发展的重要介质。高血糖、脂代谢紊乱、高血压等因素可促进一氧化氮合酶(NOS)表达增加，进而促进NO 释放增多，NO 同时作用于出入球小动脉，但出球小动脉对NO 不甚敏感。因此，大量产生的NO 使入球小动脉舒张，肾血流量增加，造成肾小球率过滤增加［4，6-7］。研究发现体内有三种NOS，分别为神经型一氧化氮合酶(nNOS)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)及内皮型一氧化氮合酶(eNOS)。其中eNOS 主要在肾血管内皮中表达，依靠Ca+/CaM 激活，经过复杂的信号传导通路引起NO 释放增加，促进入球小动脉舒张，肾血流量增加，进而引起肾小球高滤过［8］。

3.2 肾络瘀滞是DN 主要的病理环节

本研究组认为消渴病肾病是消渴病日久，久病入络，出现的肾系并发症，主要表现为尿浊、水肿、腰痛、癃闭、关格，其病位在肾，继发于消渴病，因此称为消渴病肾病。络病是贯穿于消渴病肾病始终的病理状态。发病之初，病在肝肾，气阴两虚，肾络瘀滞。病程迁延，阴损及阳，脾肾虚衰，肾络瘀阻。病变晚期，五脏受损，肾络瘀结。消渴病肾病的基本病理环节为肾络瘀滞，肾络瘀阻、肾络瘀结［9］。在消渴病肾病病程中，“瘀”贯穿此中。因此，化瘀通络为消渴病肾病重要的治疗法则。本实验选用通心络干预早期糖尿病肾病模型大鼠。通心络是根据中医络病理论研制而成的中药复方，由人参、水蛭、全蝎、土鳖虫、蜈蚣、蝉蜕、赤芍及冰片等组成。诸药合用，益气通络，有活血畅脉之佳效，无耗气伤血之弊，使气旺血行，络脉畅通。前期临床及实验研究均显示，通心络可有效降低、消除糖尿病肾病尿微量白蛋白及改善临床症状，对控制糖尿病肾病进展具有治疗作用［10-12］。

3.3 通心络可有效改善糖尿病肾病早期肾小球高滤过状态

实验结果显示，与空白组比较，模型组大鼠24小时UAER 及Ccr 在治疗8 周处于高水平，肾重及肾重指数显著增加，肾组织NO 含量增加，eNOS 蛋白表达增强，说明DN 大鼠于8 周肾小球处于高滤过状态。经过药物干预，与模型组大鼠比较，治疗组大鼠24 小时UAER 及Ccr 显著降低，肾重及肾重指数减小，肾组织NO 含量增加，eNOS 蛋白表达减弱。说明缬沙坦及通心络可调节DN 大鼠的肾功能，有效改善DN 大鼠早期肾小球高滤过状态。其作用机制可能与通心络抑制eNOS 蛋白表达，使NO的释放减少，促使肾小球入球小动脉舒张减弱，改善肾小球高滤过状态有关。

3.4 展望

本实验初步探讨了通络干预疗法对糖尿病肾病大鼠的治疗作用。实验结果表明，通心络可有效改善糖尿病肾病大鼠早期高滤过状态，其作用机制可能与降低肾组织NO 含量及eNOS 蛋白表达量有关。其具体作用机制及对糖尿病肾病的远期疗效有待进一步研究。

［1］Parving HH，Hovind P，Rossing K，et al.Evolving strategies for renoprotection:diabetic Nephropathy［J］.Curr Opin Nephrol Hypertens，2001，10(4):515-522.

［2］Perkins BA，Aiello LP，Krolewski AS.Diabetes complications and the rennin-angiotensin system［J］.N Engl J Med，2009，361(1):83-85.

［3］Jerums G，Premaratne E，Panagiotopoulos S，et al.The clinical significance of hyperfiltration in diabetes［J］.Diabetologia，2010，53(10):2093-2104.

［4］Dellamea BS.Nitric oxide system and diabetic nephropathy［J］.Diabetology ＆ Metabolic Syndrome，2014，6(1):17.

［5］李敏州，高彦彬，马鸣飞，等.糖尿病肾病发病机制研究进展［J］.中国实验方剂学杂志，2012，18(22):344-349.

［6］杨前勇，聂忠.NO、NOS 在早期糖尿病肾病大鼠血清中的变化［J］.江西医学院学报，2009，49(6):14-15，21.

［7］Sugimoto H，Shikata K，Matsuda M，et al.Increased expression of endothelial cell nitric oxide synthase (ecNOS)in afferent and glomerular endothelial cells is involved in glomerular hyperfiltration of diabetic nephropathy［J］.Diabetologia，1998，41 (12):1426-1434.

［8］Boo YC，Jo H.Flow-dependent regulation of endothelial nitric oxide synthase:role of protein kinase［J］.AmJ Physiol Cell Physiol，2003，285(3):C499-C508.

［9］高彦彬，赵慧玲.从络病学说论治糖尿病慢性并发症［J］.世界中医药，2007，2(6):357-359.

［10］顾忠林.通心络治疗早期糖尿病肾病32例疗效观察［J］.临床和实验医学杂志，2010，9(8):623.

［11］张美珍.通心络胶囊治疗Ⅲ期糖尿病肾病30例临床观察［J］.淮海医药，2010，28(4):354.

［12］邹大威，高彦彬，王金羊，等.通心络对自发性2 型糖尿病KK-Ay 小鼠肾功能及肾组织MMP-9、TIMP-1 表达的影响［J］.世界中医药，2013，8(7):782-786.