胶体金法与荧光RT－PCR法检测禽流感病毒结果比对分析

冯秀红 曹建伟 陆巧芬 冯开容 陈修邓 刘广芹 关建新

（广东省江门市动物疫病预防控制中心 广东江门 529000）

自2013年4月报道人感染H7N9流感以来，禽流感疫病的防控与监测再一次引起社会各界的关注[1-2]。用于禽流感病毒的检测方法主要包括传统的病毒分离鉴定、血清学方法和分子生物学方法等，其中分子生物学方法有着灵敏、特异、快速、准确及易于操作等优点，成为当前禽流感病毒检测的主要发展方向[3]。江门市动物疫病预防控制中心在严格进行日常的禽流感疫病监控的同时，通过增加对活禽批发市场的抽样检测数量，及时监测并掌握疫病特别是禽流感疫病的流行及发展动态。对于所采集到的禽流感样品，如，咽/泄殖腔拭子、环境样品等，从经济、方便和快捷的角度考虑，疫控中心一向选用胶体金方法进行检验。但面对来势汹汹的禽流感，要提高检测的准确度和检测速度就要求采用检测结果更准确的国标荧光RT-PCR法，此法具有用样少、特异性强、敏感性高及快速准确等特点，大大缩短了对AIV的检出时间，为我国禽流感的综合防制提供了先进、有效的早期快速诊断技术[4]。

本着“公正、科学、准确、高效”的实验室管理方针，为确保对禽流感疫病检测结果的准确性，自2013年10月起，实验室就尝试采用不同的检测方法进行比对试验，通过对江门市区内耙冲市场、江南批发市场及新会奇榜市场3个活禽交易批发市场每月2次随机定量抽样，然后对抽取的样品采用胶体金与国标荧光RT-PCR2种方法进行检测结果比对试验，根据实验结果分析选取最合适的实验检测方法。得出结论是为了确保检测的准确性，在重要和关键时期，选用荧光RT-PCR样品进行检测是比较合适的。胶体金法检测相对荧光RT-PCR法有一定漏检和误检现象，只适用于正常时期的一般性检测。

1 研究内容

1.1 实验材料

实验样品采集要求：每月随机2次，到3个市场采集至少3个不同品种的禽只各10份咽/泄殖腔拭子[5]、10份环境样品（混样）。

1.2 实验试剂

禽流感快速检测条（广州瑞森生物科技有限公司），韩国Anigen禽流感快速诊断试剂卡（韩国Anigen），禽流感病毒通用型荧光RT-PCR检测试剂盒（深圳澳东检验检测科技有限公司），内含RNA提取液、反应液、阳性对照、阴性对照、tap酶、反转录酶、RT-PCR反应液和DEPC水；自备：氯仿、异丙醇和75%酒精。

1.3 实验方法

1.3.1 荧光RT－PCR法(参照禽流感病毒通用荧光RT-PCR检测方法（GB/T19438.2-2004）)

（1）取若干个Eppendorft管，分别加入阴阳对照和已处理的样品200μL，加入裂解液600μL，吸打混匀，再加入200μL氯仿，振荡混匀，静置5min，12000rpm离心10min。

（2）吸取上层液相转入新的eppendorft 管 中 ， 再 加 入400μL-20℃预冷的异丙醇，颠倒混匀，静置5min，12000rpm离心10min。

（3） 轻轻倒去上清，加入700μL75%乙醇，颠倒润洗几次，12000rpm离心5min。轻轻倒去上清，倒置于吸水纸上，尽量沾干液体。

（4）4000rpm离心10s，用微量移液器尽量将残余液体吸干，室温干燥1～5min。

（5）加入15μLDEPC水，轻弹混匀，溶解管壁上的RNA，-18℃以下保存备用。

（6）每份总体积25μL。取19μLRT-PCR反应液 (用前混匀)、0.5μLtap酶、0.5μL反转录酶，5μL样品RNA。反应体系配制如表1。

（7）取20μL反应体系配制液，分装成n份，分别加入5μL样品RNA。做好标记，在荧光PCR仪上进行以下循环：50℃20min，95℃3min；扩 增 条 件 为95℃5s，55℃20s，72℃20s，5个循环95℃5s，60℃40s，40个循环，在60℃处收集荧光。

1.3.2 胶体金法

操作方法[6]：将采集样品浸入样品稀释液，充分搅拌混匀后，静置少许时间，用一次性滴管取上清液（样品若不能立即测试，应冷藏保存，超过24小时，应冷冻保存）。将未开封的试纸卡和检测样品恢复至室温。将试纸卡水平放置，用滴管向试卡孔缓慢逐滴加入3滴不含气泡的检测液，5分钟判断结果。

2 结果与分析

胶体金法和荧光RT-PCR法检测3次（91、96、96份）拭子抗原，结果见表2、表3和表4。

（1）由表1可见，2013年10月15日91份拭子，用胶体金法（瑞森）检测禽流感抗原，阳性23份，阳性率25.27%；用荧光RT-PCR法检测禽流感抗原，阳性21份，阳性率23.08%。2013年11月5日96份拭子，用胶体金法（瑞森）检测禽流感抗原，阳性23份，阳性率23.96%；用胶体金法（韩国Anigen）检测禽流感抗原，阳性0份，阳性率0；用荧光RT-PCR法检测禽流感抗原，阳性22份，阳性率22.92%。2013年11月12日96份拭子，用胶体金法（韩国Anigen）检测禽流感抗原，阳性1份，阳性率1.04%；用荧光RT-PCR法检测禽流感抗原，阳性22份，阳性率22.92%。

表1 反应体系

表2 胶体金法和荧光RT-PCRifc检测禽流感抗原结果数据汇总

表3 胶体金法（瑞森）和荧光RT-PCR法检测禽流感抗原结果符合情况

表4 胶体金法（韩国Anigen）和荧光RT-PCR法检测禽流感抗原结果符合情况

（2）由表2可见，2种方法检测结果不相符的有81份。其中38份胶体金法（瑞森）为阴性，荧光RT-PCR法检测为阳性；43份体金法（瑞森）为阳性，荧光RT-PCR法检测为阴性。由表3可见，2种方法检测结果不相符的有85份。其中44份胶体金法（韩国Anigen）为阴性，荧光RT-PCR法检测为阳性；1份胶体金法（韩国Anigen）为阳性，荧光RT-PCR法检测为阴性。胶体金法检测相对荧光RT-PCR法有一定漏检和误检现象存在。

（3）由表2可见，相对荧光RT-PCR法检测，胶体金法（瑞森）检测阳性（a）为3份，阴性（d）为103份，假阳性（b）为43份，假阴性（c）为38份。胶体金法检测灵敏度＝a/(a+c)×100%＝7.32%；特异度＝d/(b+d)×100%＝70.55%；漏检率＝c/(a+c)×100%=92.68%;误诊率＝b/(b+d)×100%＝29.45%；诊断符合率＝(a+d)/(a+b+c+d)×100%＝56.68%。由表3可见，相对荧光RT-PCR法检测，胶体金法（韩国Anigen）检测阳性（a）为0份，阴性（d）为147份，假阳性（b）为1份，假阴性（c）为44份。胶体金法检测灵敏度＝a/(a+c)×100%＝0%；特异度＝d/(b+d)×100%＝99.32%；漏检率＝c/(a+c)×100%=100%;误诊率＝b/(b+d)×100%＝0.67%； 诊断符合率＝(a+d)/(a+b+c+d)×100%＝76.56%。

（4）从分析可知，两家公司的速测条检测结果假阴与假阳性情况都比较严重，假阳性使正常健康的禽只被误诊为患病禽只，这对养殖户与销售档主都可能带来不必要的损失，而假阴性使患病禽只被误诊为正常健康禽只，则不能及时有效地发现疫病的发生并杜绝疫病的传播，这对于禽流感疫病的监测防控是一个严重的漏洞。

（5）胶体金法因其使用方便，检测时间短，而且成本较低，面对大量检测的样品，可以相对降低实验经费的支出，节省时间，但结果误差率较大，尤其是假阳性率过高；荧光RT-PCR检测结果准确，但其试剂相对较贵，实验步骤复杂，实验硬件要求高，面对大量检测时，在时间与经费方面考虑，都存在实质性的可行性操作问题。为了确保检测的准确性，在重要和关键时期，选用荧光RT-PCR样品进行检测是比较合适的。这次研究试验为今后的工作开展指明了方向。

[1]孙国根，记者王春项铮，发现新型人感染H7N9禽流感病毒[N].科技日报，2013年4月13日第001版.

[2]通讯员朱海洋，记者潘剑凯，H7N9禽流感研究取得重大突破[N].光明日报，2013年4月28日第002版.

[3]柯艳坤，陈晓春，齐岩，等.禽流感病毒检测方法的研究进展[J].中国家禽，2008年第30卷第14期.

[4]EspyMJ,UhlJR,SloanLM,etal.Real-timePCRinclinicalmicrobiology:applicationsforroutine laboratorytesting[J].ClinMicrobiol Rev,2006,19(1):1652256.

[5]包红梅，王秀荣，刘丽玲，等.禽流感病毒一步法RT-PCR检测方法的建立[J].中国兽医科学，2006,36(09):701-706.

[6]彭伏虎，胡思顺，王政，等.通用型禽流感病毒胶体金快速检测试纸条的研制与应用研究[C].首届中国兽药大会——兽医生物制品学、兽医微生物学学术论坛论文集（2008）.

[7]向林远，杜国芹.胶体金法与ELISA法检测猪瘟抗体结果对比分析[J].湖北畜牧兽医，2012年7月10日第8期.