壮骨1号方镇痛抗炎作用研究*

钟文婕，柳占彪，王安红，田文全

（天津中医药大学中医药研究院，天津 300193）

壮骨1号方镇痛抗炎作用研究*

钟文婕，柳占彪，王安红，田文全

（天津中医药大学中医药研究院，天津 300193）

[目的]观察壮骨1号方镇痛和抗炎作用。[方法]采用小鼠热板法和醋酸扭体法，观察壮骨1号方的镇痛作用；采用木瓜蛋白酶缓释剂法建立大鼠关节炎模型，观察壮骨1号方的抗炎作用。[结果]壮骨1号方3．08、1．54g/kg剂量能明显延长热板所致的小鼠舔后足时间（60 min，19．78 s，P＜0．05和20．56 s，P＜0．01）、（90 min，20．67 s和20．56 s，P＜0．05），显著减少小鼠扭体反应的次数（P＜0．01）；壮骨1号方各剂量能明显减少大鼠白细胞数和中性粒细胞数（P＜0．01），降低大鼠关节周围软组织IL-6含量（P＜0．01）、降低关节液IL-6和前列腺素E2（PGE2）含量（P＜0．01）。[结论]壮骨1号方具有明显的镇痛和抗炎作用。

壮骨1号方；镇痛；抗炎

骨关节炎（OA）是以关节软骨损伤为特征的退行性关节病，主要临床症状表现为关节肿胀、畸形、功能障碍、走路疼痛等[1]，以中老年居多，随着社会人口老龄化的到来，其发病率呈逐年上升的趋势，越来越受到医学界的关注和重视。近年来中医药治疗OA的研究取得了一定的进展[2]。壮骨关节丸是治疗OA的经典方，主要由熟地黄、补骨脂、淫羊藿、独活、续断等组成，用于肝肾不足、气滞血瘀、脉络痹阻所致的OA、腰肌劳损，但临床报道该药会引起肝损害[3-4]，为此，本课题组在壮骨关节丸经典方的基础上进行了壮骨1号方的研究，本实验对壮骨1号方的镇痛和抗炎作用进行了实验观察。

1 材料

1.1动物 昆明种小鼠，18～22 g，雌性，SPF级，天津实验动物中心，合格证号：SCXK(津)2010-0002，批号：0004259。SD大鼠，体质量（200±20）g，天津市山川红实验动物科技有限公司，实验动物生产合格证：SCXK（津）2009-0001。质量合格证：0004244。

1.2药物 壮骨1号方（自制，批号：1006103）；壮骨关节丸（批号：1011231S），华润三九医药股份有限公司；木瓜蛋白酶(批号：118K1465)，泊洛沙姆（批号：P2443），Sigma公司。

1.3试剂 冰醋酸（批号：20101221），天津市化学试剂批发公司。大鼠前列腺素E2（PGE2）ELISA试剂盒（批号：291348），美国R＆D公司。大鼠白介素-6（IL-6）ELISA试剂盒（批号：113102/A），美国Invitrogen公司。BCA蛋白浓度测定试剂盒（批号：P0012），上海碧云天公司。

1.4仪器 HSS-1（B）恒温浴槽，成都仪器厂。热板槽，秒表，计数器。全自动血细胞分析仪，MEK-7222K型，日本光电工业株式公社。离心机，LDZ5-2型，北京芬格尔华安科技有限责任公司生产。涡旋混合器，QL-901型，海门市其林贝尔仪器制造有限公司。振荡器，KJ-201A型，江苏康健医疗用品有限公司。杂交箱，MODEL 1012型，SHEL LAB，美国。多功能酶标仪，FlexStation 3，Molecular Devices公司，美国。

2 方法

2.1小鼠热板实验[5]选昆明小鼠，雌性，体质量（20±2）g，分别置于恒温热板槽上（55±0．5）℃，从小鼠放入热板槽开始计时，以舔后足为痛反应指标，将痛阈值在5～30 s之间的小鼠用于实验。选符合实验要求的小鼠60只，按随机数字表法随机分为6组，分别为空白对照组、壮骨1号方3．08、1．54、0．77 g/kg剂量组和壮骨关节丸1．54 g/kg组，每组10只。按每只0．5 mL的给药量，每日1次，连续灌胃治疗3 d。对照组灌胃等量体积的蒸馏水。分别在给药前和给药结束后30、60、90 min，测定小鼠的痛阈值。

2.2小鼠醋酸扭体实验[6]选昆明小鼠60只，雌性，体质量（20±2）g，按随机数字表法随机分为6组，分别为空白对照组、壮骨1号方3．08、1．54、0．77 g/kg剂量组和壮骨关节丸1．54 g/kg对照组，每组10只。按每只0．5 mL的给药量，每日1次，连续灌胃治疗5 d，空白对照组灌胃等量体积的蒸馏水。末次给药后30 min，每只小鼠分别腹腔注射0．6%冰醋酸0．2 mL（现配现用），观察并记录注射后15 min内小鼠的扭体次数（以腹部内凹，伸展后肢，臀部抬高为标准），比较给药组与对照组之间的差异并计算扭体反应抑制率。

扭体反应抑制率（100%）=（对照组平均扭体次数-给药组平均扭体次数扭体）÷对照组平均扭体次数×100%。

2.3抗炎实验

2.3.1造模[7]选健康雄性SD大鼠，按3 mL/kg腹腔注射10%的水合氯醛麻醉，大鼠双侧膝关节注射4%木瓜蛋白酶35%泊洛沙姆磷酸缓冲溶液（pH= 5．7），每侧0．05 mL，50℃恒温作用2 h。

2.3.2分组与灌胃 选成功骨关节炎模型大鼠40只，按随机数字表法随机分为模型组、壮骨1号方2．20、1．10、0．55 g/kg剂量组和壮骨关节丸1．10 g/kg组，每组8只，另选健康雄性SD大鼠8只，作为正常对照组。按不同的剂量灌胃给药，连续治疗3 d，正常组和模型组灌等体积蒸馏水。

2.3.3取材 治疗结束后，麻醉，腹主动脉取血，打入按9∶1预先含有枸橼酸的炮弹管中，上下振摇使其充分混匀做血常规；剩余血液3 500 r/min离心10 min，分离血清；打开左膝关节腔，用0．8 mL生理盐水反复冲洗3次，收集关节液，3 000 r/min离心10 min，取上清液，4℃保存；用小刀刮取股骨关节和胫骨关节周围的软组织，称质量，按质量体积比加生理盐水制备成10%的组织匀浆液，3 500 r/min离心10 min，取上清液，4℃保存。

2.4统计学分析 应用SPSS18．0统计学软件处理数据，计量资料采用均数±标准差（±s）表示。正态分布计量资料组间比较采用单因素方差分析，组间

两两比较时，若方差齐采用LSD法，若方差不齐采用Dunnett’s T3法；偏态分布计量资料组间比较采用秩和检验，P＜0．05为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1小鼠热板法实验结果 给药后60、90 min，壮骨1号方3．08、1．54 g/kg剂量小鼠痛阈值明显增加，与空白对照组差异有统计学意义（P＜0．05或P＜0．01）。结果表明：壮骨1号方能明显延长小鼠的痛反应时间，能有效缓解物理性热刺激，具有明显的镇痛作用。见表1。

表1 壮骨1号方对小鼠热板痛反应的影响（±s）Tab.1 Effect of hot plate pain reaction on mice by Zhuanggu Yihao prescription（±s）

表1 壮骨1号方对小鼠热板痛反应的影响（±s）Tab.1 Effect of hot plate pain reaction on mice by Zhuanggu Yihao prescription（±s）

注：与空白对照组比较，*P＜0．05，**P＜0．01。

组别空白对照组壮骨1号方3．08 g/kg组壮骨1号方1．54 g/kg组壮骨1号方0．77 g/kg组壮骨关节丸1．54 g/kg组动物数（只）10 10 10 10 10痛阈值（s）给药前 30 min 60 min 90 min 15．44±3．28 14．67±3．00 15．11±2．52 16．00±2．87 14．67±2．91 19．00±9．58 19．78±4．63* 20．67±3．97* 16．11±2．52 17．22±3．53 20．56±6．19** 20．56±6．48* 14．78±3．49 19．86±9．23 18．00±3．84 19．56±4．64 16．56±3．97 19．56±3．84 19．78±1．56* 20．78±1．56*

3.2小鼠醋酸扭体实验结果 壮骨1号方3．08、1．54、0．77 g/kg剂量能明显降低因醋酸刺激引起的扭体反应次数，与空白对照组差异有统计学意义（P＜0．01），其中壮骨1号方3．08 g/kg剂量扭体抑制率最高。结果表明：壮骨1号方都能明显减少小鼠扭体的次数，提示壮骨1号方具有明显的镇痛作用。见表2。

3.3抗炎结果

3.3.1血液白细胞及分类检查结果 模型组大鼠血液中白细胞总数和中性粒细胞总数明显升高，与正常组大鼠差异有统计学意义（P＜0．01），说明造模后，引起了大鼠关节的急性炎症。用壮骨1号方2．20 g/kg和1．10 g/kg和0．55 g/kg剂量灌胃治疗3 d后，大鼠白细胞总数明显降低（P＜0．05或P＜0．01），中性粒细胞也显著性下降（P＜0．01）。结果表明：壮骨1号方具有抗炎作用。见表3。

3.3.2壮骨1号方对OA大鼠IL-6和PGE2含量的影响 模型组大鼠关节周围软组织和关节液中IL-6含量明显高于正常组（P＜0．01）；壮骨1号方灌胃治疗3 d后，大鼠IL-6含量明显降低，与模型组差异有统计学意义（P＜0．05或P＜0．01）。模型组大鼠关节液中IL-6和PGE2含量明显高于正常组（P＜0．01），壮骨1号方灌胃3 d治疗后，大鼠关节液中IL-6和PGE2含量明显降低，与模型组差异有统计学意义（P＜0．01）。结果表明：壮骨1号方抑制关节软骨破坏可能是通过减少炎症细胞因子IL-6和PGE2的破坏作用实现的，提示其对骨关节炎的疗效与其抑制关节内的IL-6和PGE2水平密切相关。见表4。

表2 壮骨1号方对小鼠醋酸扭体的影响（±s）Tab.2 Effect of acetic acid writhing on mice by Zhuanggu Yihao prescription（±s）

表2 壮骨1号方对小鼠醋酸扭体的影响（±s）Tab.2 Effect of acetic acid writhing on mice by Zhuanggu Yihao prescription（±s）

注：与空白对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

组别空白对照组壮骨1号方3．08 g/kg组壮骨1号方1．54 g/kg组壮骨1号方0．77 g/kg组壮骨关节丸1．54 g/kg组动物数（只）10 10 10 10 10扭体数（次） 扭体抑制率（%）22．42±3．36** 100．00 11．56±4．82** 051．09 14．67±4．64** 037．92 14．33±6．56** 039．33 13．78±4．79** 041．68

表3 壮骨1号方对血液白细胞及分类的影响（±s）Tab.3 Effect of Zhuanggu Yihao prescription on blood leukocytes and classification（±s）

表3 壮骨1号方对血液白细胞及分类的影响（±s）Tab.3 Effect of Zhuanggu Yihao prescription on blood leukocytes and classification（±s）

注：与正常组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。

组别正常组模型组壮骨1号方2．20 g/kg组壮骨1号方1．10 g/kg组壮骨1号方0．55 g/kg组壮骨关节丸1．10 g/kg组动物数（只）8 8 8 8 8 8白细胞总数（×109/L） 中性粒细胞（×109/L） 淋巴细胞数（×109/L）4．07±1．68 2．23±0．84 2．00±0．89 6．02±1．34** 4．62±1．27** 1．31±0．42* 2．92±1．96##1．92±1．28##0．97±0．81** 4．07±2．88#2．45±1．64##1．62±1．28 3．67±0．94##2．57±0．55##2．02±2．83** 3．77±1．75##2．51±1．25##1．24±0．67*

表4 壮骨1号方对OA大鼠IL-6和PGE2含量的影响（±s）Tab.4 Effect of Zhuanggu Yihao prescription on the IL-6 and PGE2 in rats with OA（±s）

表4 壮骨1号方对OA大鼠IL-6和PGE2含量的影响（±s）Tab.4 Effect of Zhuanggu Yihao prescription on the IL-6 and PGE2 in rats with OA（±s）

注：与正常组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。

组别正常组模型组壮骨1号方2．20 g/kg组壮骨1号方1．10 g/kg组壮骨1号方0．55 g/kg组壮骨关节丸1．10 g/kg组动物数（只）6 6 6 6 6 6关节液IL-6（pg/mg） 关节液PGE2（pg/mg） 关节周围软组织IL-6（pg/mL）12．81±05．89 753．17±658．50 179．71±40．10 101．68±85．10** 3 935．91±1 469．24** 427．18±35．37** 15．44±12．29##1 560．03± 681．48##326．89±27．54**#16．02±05．08##1 502．90± 554．13##288．16±57．48*##28．74±18．47##995．26± 503．62##254．51±54．15##36．32±25．48##2 387．04± 527．75* 273．79±40．10##

4 讨论

壮骨关节丸具有较好的临床镇痛作用，但未见实验研究报道，其组方中独活、乳香、没药等单味药的镇痛作用已有报道。有研究显示[8]采用小鼠热板法及小鼠扭体法对40只小鼠研究中发现，独活挥发油0．29 g/kg（生药96．66 g）剂量具有明显的镇痛作用。另有报道[9]采用小鼠扭体法对24只小鼠研究中发现，乳香没药挥发油0．102 g/kg（生药5．66 g）剂量具有明显的镇痛作用。本实验采用小鼠热板法及小鼠扭体法，结果表明壮骨1号方在1．54 g/kg剂量，壮骨关节丸在1．54 g/kg剂量（独活生药为0．7g，乳香没药生药为1．4 g），均具有镇痛作用。从单味药的给药剂量和在壮骨1号方、壮骨关节丸中单味药的给药剂量比较，复方中的用药剂量均小于单味药的给药剂量，由此认为复方具有协同增效作用。

本实验还对壮骨1号方的抗炎作用进行了研究，主要研究PGE2和IL-6这两个炎症因子，它们在关节炎发生发展中起着重要的作用。PGE2作为炎症因子在疼痛尤其是炎症性疼痛的外周和中枢中扮演重要角色。有学者对16例疼痛性患者关节腔内注射醋酸强的松龙治疗，测定治疗前后关节液中PGE2含量，结果注药后3周和9周滑液中PGE2含量较注药前有显著下降（P＜0．01），同时关节疼痛症状明显改善，表明PGE2含量与关节疼痛密切相关[10]。研究表明可以通过降低关节滑液PGE2含量抑制炎症反应，改善关节周围组织的痛觉过敏状态，缓解疼痛，达到治疗OA的效果[11]。目前认为抑制体内PGE2的生物合成是解热疼痛抗炎药共同的作用基础[12]。IL-6在炎症中具有重要作用，抑制IL-6合成是抗炎的有效途径[13]。有研究利用药物干预，有效降低了软骨及血清IL-6，从而减轻炎症及免疫反应[14]。亦有研究观察丹归消肿膏治疗大鼠急性软组织损伤的肿胀、瘀斑消退情况及IL-6和PGE2含量变化，结果显示丹归消肿膏能快速消除软组织肿胀、瘀斑，抑制损伤局部的IL-6和PGE2含量，减少损伤局部炎性反应[15]。另有学者观察膝关节液中IL-18、PGE2、IL-6含量，结果表明关节滑液中PGE2、IL-6含量增加，并与IL-18呈正相关[16]。本实验发现壮骨1号方和壮骨关节丸能够降低OA大鼠PGE2和IL-6含量，提示壮骨1号方和壮骨关节丸的镇痛抗炎作用机制是通过阻断PGE2和IL-6的合成实现的。

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Research on effect of Zhuanggu Yihao prescription in agalgesia and anti-inflammatory action

ZHONG Wen-jie,LIU Zhan-biao,WANG An-hong,TIAN Wen-quan
（Research Institute of Traditional Chinese Medicine,Tianjin University of Traditional Chinese Medicine,Tianjin 300193,China）

[Objective]To observe the effects of Zhuanggu Yihao prescription in the analgesia and anti-inflammatory action．[Methods]Using the method of mouse hot plate and acetic acid writhing the analgesia of Zhuanggu Yihao prescription was observed;papain was injected into rat’s knee joints to establish the animal model of osteoarthritis and to observe the anti-inflammation by Zhuanggu Yihao prescription．[Results]The pain caused by the hot plate was significantly extended in Zhuanggu Yihao prescription of 3．08,1．54g/kg dose group (60 min,19．78 s,P＜0．05 and 20．56 s,P＜0．01),(90 min,20．67s and 20．56 s,P＜0．05),and the number of writhing was reduced in Zhuanggu Yihao prescription of 3．08,1．54g/kg dose group (P＜0．01)．Zhuanggu Yihao prescription could obviously reduce the leukocyte count and neutrophil count(P＜0．01),and reduce the contents of IL-6 in the soft tissue homogenate（P＜0．01）and reduce the contents of IL-6 and PGE2in synovial fluid（P＜0．01)．[Conclusion]Zhuanggu Yihao prescription has significant analgesia and anti-inflammatory effect．

Zhuanggu Yihao prescription;analgesia;anti-inflammatory

R285．6

A

1672-1519（2014）12-0752-04

2014-06-14）

（本文编辑：马 英，于春泉）

10．11656/j．issn．1672-1519．2014．12．15

国家“重大新药创制”科技重大专项（2011ZX 09201-201-21）。

钟文婕（1989-），女，硕士，主要从事中药药理研究。

柳占彪，E-mail：634256747＠qq．com。