LC-MS/MS法测定升麻中咖啡酸、阿魏酸、异阿魏酸含量的研究*

王晓明，张 帆，刘 莹，2，张 娜，2

（1．天津中医药大学，天津市现代中药重点实验室－省部共建国家重点实验室培育基地，天津 300193；2．天津国际生物医药联合研究院，天津 300457）

·中药研究·

LC-MS/MS法测定升麻中咖啡酸、阿魏酸、异阿魏酸含量的研究*

王晓明1，张 帆1，刘 莹1，2，张 娜1，2

（1．天津中医药大学，天津市现代中药重点实验室－省部共建国家重点实验室培育基地，天津 300193；2．天津国际生物医药联合研究院，天津 300457）

[目的]建立LC－MS/MS测定升麻药材中3种苯丙酸类成分含量的方法。[方法]采用ACQUITY UPLC® BEH C18（2．1 mm×100 mm，1．7 μm）色谱柱，乙腈－0．1%甲酸水为流动相，梯度洗脱，流速为：0．3 mL/min；质谱检测器：采用ESI电离源，负离子检测，MRM监测模式，对升麻药材中苯丙酸类成分咖啡酸、阿魏酸、异阿魏酸进行含量测定。[结果]咖啡酸、阿魏酸、异阿魏酸的线性范围分别为5～100 ng/mL，10～200 ng/mL，50～1 000 ng/mL，线性关系良好，最低定量限分别为5、10和50 ng/mL，加样回收率97．83%～98．40%。[结论]该方法简便，快速，精密度高，重复性好，可用于同时测定升麻中咖啡酸、阿魏酸、异阿魏酸的含量。

LC－MS/MS；升麻；咖啡酸；阿魏酸；异阿魏酸

升麻具有发表透疹、清热解毒、升举阳气的功效，主要用于风热头痛、齿痛、口疮、咽喉肿痛、麻疹不透、阳毒发斑、脱肛、子宫脱垂[1－7]。升麻中主要含有机酸、三萜化合物和香豆素等化学成分，其中苯丙酸类成分主要有咖啡酸（caffeic acid）、阿魏酸（ferulic acid）和异阿魏酸（isoferulic acid）等。咖啡酸具有抗菌、抗病毒、中枢兴奋、解毒、凝血的作用；阿魏酸可抑制血小板聚集、抗血栓形成、解除血管平滑肌痉挛、改善心肌缺血、抗炎止痛、抗紫外线辐射、抗自由基以及调节人体免疫功能等；异阿魏酸具有解热、镇痛、消炎的作用[8－12]。

《中华人民共和国药典》（2010年版）记载，升麻是以异阿魏酸的含量作为质控标准。虽然国内已有利用高效液相色谱法－紫外检测器（HPLC－UV）同时测定升麻中咖啡酸、阿魏酸和异阿魏酸含量的文献报道[13－14]，但该方法耗时较长，检测灵敏度较差。为此本研究建立液质联用/质谱（LC－MS/MS）同时测定升麻药材中咖啡酸、阿魏酸、异阿魏酸含量的方法，可大大节省检测时间，且具有较高的灵敏度，可为升麻药材的质量控制提供参考。

1 实验试药与仪器

1.1 试药 甲醇（色谱纯，美国Fisher Scientific公司），乙腈（色谱纯，美国Fisher Scientific公司），甲酸（色谱纯，美国MREDA公司，≥96．0%），超纯水（Milipore制备）。

咖啡酸、阿魏酸、异阿魏酸标准品（均购自中国药品生物制品检定所，纯度＞98%），染料木素Genistein（由沈阳药科大学提供，纯度＞98%）。

升麻药材于2013年购买于河北省安国药材市场，经天津中医药大学李天祥副教授鉴定为兴安升麻Cimicifuga．dahurica（Turcz．）Maxim．。

1.2 仪器 Waters Acquity UPLC－Quattro Premier XE液相色谱质谱联用仪，MassLynx 4．1工作站，序列号：VAB1217；超纯水器（Millipore公司，Mill－QⅡ型）；万分之一天平（德国Sartorius公司，BP121S）；旋涡混合器（SCILOGEX MX－S vortexer）；高速离心机（Hettich MIKRO 220R centrifuge）；超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司，KQ－250E）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱：ACQUITY UPLC®BEH C18（2．1 mm×100 mm，1．7 μm）；流动相：乙腈－0．1%甲酸水溶液，梯度洗脱；流速：0．3 mL/min；柱温：50℃；进样体积：10 μL。梯度洗脱程序见表1，各成分的色谱分离情况见图1～2。

2.2 质谱条件 采用ESI电离源，负离子扫描，MRM检测模式。毛细管电压：2.8 kV；离子源温度：120℃；去溶剂化温度：350℃；去溶剂化气流强度：650 L/Hr；锥体气流强度：50 L/Hr；碰撞电压在16～27 V。

经优化后最终确定各化合物检测离子对为：咖啡酸离子对178.61/134.61，阿魏酸离子对192.77/ 133.63，异阿魏酸离子对192.80/133.63，内标染料木素离子对268.73/132.53。见图3～6。

表1 色谱梯度洗脱程序Tab.1 HPLC gradient elution program

图1 标准品和内标色谱图Fig.1 Standard and internal standard chromatogram

图2 升麻药材样品色谱图Fig.2 Sample chromatogram of Rhizoma Cimicifugae

图3 咖啡酸二级质谱图Fig.3 Fragmentation of caffeic acid

图4 阿魏酸二级质谱图Fig.4 Fragmentation of ferulic acid

图5 异阿魏酸二级质谱图Fig.5 Fragmentation of isoferulic acid

图6 染料木素二级质谱图Fig.6 Fragmentation of Genistein

2.3 溶液的制备

2.3.1 混合标准品储备液的配制 精密称取咖啡酸2.0 mg、阿魏酸4.0 mg置100 mL容量瓶中，异阿魏酸5.0 mg标准品置25 mL容量瓶中，加甲醇-0.5%甲酸水溶液（8∶2）定容至刻度，分别配制成浓度为20、40和200 μg/mL的2种标准品储备液。

精密移取2种标准品储备液各10mL置100mL容量瓶中，加入甲醇-0.5%甲酸水溶液（8∶2）定容至刻度，得混合标准品溶液，备用。

2.3.2 内标溶液的配制 精密称取染料木素5.0 mg置50 mL容量瓶中，加甲醇-水（1∶1）溶液定容至刻度，混匀后稀释，最终制成浓度为100 ng/mL的内标溶液，备用。

2.3.3 供试品溶液的配制 精密称取升麻药材粉末（过10目筛）0.50 g置25 mL容量瓶中，加入甲醇-0.5%甲酸水溶液（8∶2），超声40 min，冷却至室温后定容。摇匀，取适量提取液，15 000 r/min离心10 min，精密移取上清液50 μL，用内标溶液稀释20倍后进样，测定。

2.4 方法学考察

2.4.1 线性关系的考察 取“2.3.1”中混合标准品溶液逐级稀释，得系列混合标准品溶液，精密移取各系列混合标准品溶液50 μL，准确加入“2.3.2”中的内标溶液稀释20倍，最终配制成咖啡酸浓度为5、10、25、37.5、50、75、100 ng/mL；阿魏酸浓度为10、20、50、75、100、150、200 ng/mL；异阿魏酸浓度为50、100、250、375、500、750、1 000 ng/mL的混标溶液，涡旋，混匀，进样。

表2 3个化合物的回归方程和线性关系Tab.2 The calibration curves and linearity range for the three components of the assay

2.4.2 精密度与准确度 分别取低、中、高3个浓度的标准品溶液，按照“2.4.1线性关系的考察”方法进行操作，测定咖啡酸、阿魏酸、异阿魏酸与内标染料木素的峰面积比值，代入回归方程，计算浓度。结果显示：3个化合物的精密度RSD<15%，准确度偏差小于15%。

2.4.3 加样回收率实验 精密称取已知含量的升麻药材适量，分别加入适量的咖啡酸、阿魏酸、异阿魏酸与内标染料木素，平行操作6份，按照“2.3.3”项下方法进行处理与测定，以(测得值-基础值)/加标值×100%计算回收率，结果显示：3个化合物的回收率分别为咖啡酸98.40%、阿魏酸98.12%、异阿魏酸97.83%。

2.4.4 样品稳定性 取系列混标溶液样品，于4℃条件下分别放置0、2、4、8、10、12 h，以测定样品的稳定性，结果显示RSD<5%，表明样品溶液在4℃条件下稳定。

2.4.5 重复性考察 精密称取同一产地升麻药材适量，按照“2.3.3”方法操作，平行制备6份样品，进样，测得咖啡酸、阿魏酸和异阿魏酸的相对标准偏差分别为0.62%，1.91%和1.38%，表明方法的重复性良好。

2.4.6 样品含量测定 分别精密称取不同产地升麻药材适量，按照“2.3.3”项下的方法，每产地的药材平行操作6份，进行样品的含量测定。

表3 不同产地升麻药材中3种化合物的含量(n=6)Tab.3 Contents of three compants of Rhizoma Cimicifugae from different places(n=6)mg/g

3 讨论

3.1 定量指标的选择 升麻在2010版《药典》采用的含量测定方法是LC-UV法，且仅对异阿魏酸的含量（不得少于0．1%）有要求。鉴于咖啡酸、阿魏酸同样具有抗炎、抗氧化等功效，也是升麻的主要活性成分，因此本实验除了测定异阿魏酸，对咖啡酸、阿魏酸也进行了含量测定。液质联用法虽在之前版本的《药典》中已在附录中收载，但直到2010年，《药典》才正式引入正文用于川楝子、千里光等中药中微量成分的含量测定，用以控制此类药材的质量。升麻中阿魏酸、异阿魏酸互为同分异构体，含量相当，本实验建立的LC-MS/MS法可有效进行升麻药材质量的评价。

3.2 电离方式的选择 质谱条件的优化是通过将1 μg/mL的咖啡酸、阿魏酸、异阿魏酸的标准品溶液经由蠕动泵10 μL/min连续进样，并对各质谱参数进行考察，以待测物响应值为参考。由于测定的化合物均为酚酸，易产生[M-H]-离子，所以实验中选择负离子方式进行扫描。通过ESI源和APCI源的比较，发现采用ESI源具有更高的灵敏度和专属性，故本实验选用ESI离子源。

3.3 流动相的选择 由于阿魏酸和异阿魏酸互为同分异构体，色谱行为相似，实验最初分析比较了乙腈－水与甲醇－水的分离效果，结果表明乙腈－水比甲醇－水分离效果更好。咖啡酸、阿魏酸、异阿魏酸均为酚酸，对pH值较敏感，故在流动相中加入适量HCOOH，以提高响应、改善峰形。在色谱条件优化过程中，分别对比了乙腈－0．05%甲酸、乙睛－0．1%甲酸的分离效果，结果流动相为乙睛－0．1%甲酸时，阿魏酸、异阿魏酸分离最好，因此确定其为流动相。3.4 色谱柱的选择 实验初期选用C18（4．6 mm× 150 mm，3．5 μm）色谱柱，阿魏酸与异阿魏酸的分离效果较好，但是出峰时间过长，因而换用较短的ACQUITY UPLC®BEH C18（2．1 mm×100 mm，1．7 μm）色谱柱，调试液相条件，在保证分离效果的情况下，分析时间明显缩短。

4 结论

本研究建立了LC－MS/MS测定升麻中3个苯丙酸类成分含量的方法，结果表明该方法简便、准确、重现性好，可用于升麻药材的质量控制。

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LC-MS/MS determination of caffeic acid,ferulic acid acid,and isoferulic acid in Rhizoma Cimicifugae

WANG Xiao-ming1,ZHANG Fan1,LIU Ying1,2,ZHANG Na1,2
（1.Tianjin University of Traditional Chinese Medicine,Modern Chinese Medicine-Province and Ministry Coestablished State Key Laboratory Cultivation Base,Tianjin Key Laboratory Tianjin 300193,China;2.Tianjin International Joint Academy of Biotechnology and Medicine,Tianjin,300457）

[Objective]To develop a LC－MS/MS method for simultaneous determination of caffeic acid,ferulic acid and isoferulic acid in the Rhizoma Cimicifugae．[Methods]Chromatographic separation was achieved with gradient elution by a ACQUITY UPLC®BEH C18coloum(2．1 mm×100 mm,1．7 μm)hyphenated to a mass spectrometer system was operated under the MRM mode with electrospray negative ionization．The mobile phase was acetonitrile－0．1%formic acid aqueous and the flow rate was 0．3 mL/min．[Results]Caffeic acid, ferulic acid and isoferulic acid showed good linearity in the range of 5～100 ng/mL,10～200 ng/mL,50～1 000 ng/mL．The lower limit of quantification of the 3 essential compounds was 5,10 and 50 ng/mL respectively．The average recoveries of the method were in the range of 97．83%～98．40%．[Conclusion]The method is fast,sensitive and reproducible．It can be used for the simultaneous determination of caffeic acid,ferulic acid and isoferulic acid in the Rhizoma Cimicifuga．

LC－MS/MS；Rhizoma Cimicifugae；caffeic acid；ferulic acid；isoferulic acid

R285．5

A

1672-1519（2014）11－0686－04

2014-09-09）

（本文编辑：高 杉，马晓辉）

10．11656/j．issn．1672－1519．2014．11．13

国家自然科学基金项目（81001633，81173523，81303182），国家重大新药创制项目（2012ZX09101202），国家973计划项目（2012CB723504）。

王晓明（1982－），女，硕士，助理实验师，从事体内药物分析研究。