盆炎灌肠方对子宫内膜细胞炎症模型抗炎作用的实验研究*

赵 琳，王雅楠，宋殿荣

（天津中医药大学第二附属医院妇科，天津 300150）

盆炎灌肠方对子宫内膜细胞炎症模型抗炎作用的实验研究*

赵 琳，王雅楠，宋殿荣

（天津中医药大学第二附属医院妇科，天津 300150）

[目的]研究盆炎灌肠方对子宫内膜细胞炎症模型的抗炎作用。[方法]运用细菌脂多糖（LPS）诱导人子宫内膜细胞制作炎症模型，分为3组，正常对照组、炎症模型组、实验组，培养72 h，检测各组细胞因子白细胞介素-1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的浓度和细胞因子IL-1β、TNF-α mRNA表达及核转录因子p65（NF-κB p65）蛋白表达。[结果]盆炎灌肠方可显著降低炎症模型组炎症细胞因子IL-1β、TNF-α的分泌及其mRNA的表达，明显抑制炎症模型组细胞核中NF-κB p65蛋白表达水平。[结论]盆炎灌肠方对子宫内膜细胞炎症模型具有明显的抗炎作用，且此作用可能与NF-κB途径相关。

盆炎灌肠方；子宫内膜细胞；炎症模型；IL-1β；TNF-α；NF-κB

盆腔炎性疾病（PID）是指女性上生殖道及其周围组织的炎症，严重影响妇女健康，主要有子宫内膜炎、输卵管炎、输卵管卵巢脓肿、盆腔腹膜炎。炎症可局限于盆腔某一个部位，也可以同时累及几个部位。PID若未能得到及时正确的治疗，则可由于盆腔粘连，输卵管阻塞，导致不孕、输卵管妊娠、慢性盆腔痛，炎症反复发作等PID后遗症（SPID），其防治已成为妇科领域亟待解决的重要课题[1]。盆炎灌肠方在长期临床应用中取得显著疗效，本研究观察了盆炎灌肠方对子宫内膜细胞炎症模型的抗炎作用,初步探讨其抗炎机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 标本 子宫内膜组织取自因子宫肌瘤行妇科手术前诊断性刮宫的女性，共30例，患者无内分泌疾病及全身性疾病,月经周期规律，刮宫前3个月未服用激素类药物,标本在30 min内低温进行处理，内膜病理诊断未发现子宫内膜病理改变。

1.1.2 实验药物 盆炎灌肠方（红藤、败酱草、丹参、三棱、莪术、水红花子、川楝子、延胡索），由天津中医药大学第二附属医院提供，用超纯水配成1 g/mL药液，灭菌，4℃保存备用。

1.1.3 实验主要试剂 DMEM/F12（1∶1）培养基（HyClone，美国），胎牛血清（FBS，HyClone，美国），0．25%Trypsin－EDTA（Invitrogen，美国），Collagenase TypeⅠA（Sigma，美国），脂多糖（LPS，Sigma，美国），白介素-1β（IL－1β）、肿瘤坏死因子-α（TNF－α）酶联免疫吸附测定法（ELISA）试剂盒（西唐，上海），Quant一步法逆转录-聚合酶链反应（RT－PCR）试剂盒（天根，北京），核转录因子κB（NF－κB）p65抗体（Santa Cruz，CA）。

1.1.4 实验主要仪器 单人超净工作台（上海树立），二氧化碳培养箱（上海三发），倒置显微镜（上海光学仪器厂），PCR仪（美国应用生物系统公司），酶标仪（山东高密），电泳仪（北京凯元），凝胶电泳成像仪（北京赛智），电泳系统购自Bio-Rad，Imager Master VDS图像分析仪（AlphaInno－tech）。

1.2 方法

1.2.1 人子宫内膜细胞的培养 参照文献[2]的方法并加以改进。将组织用Hanks液洗涤直至漂洗液中无血迹为宜，剪成小碎块，加入复合消化酶，37℃水浴消化，吸取上清液加FBS终止消化，过筛网，重复消化3次，消化液离心，1 000 r/min，5 min，弃上清液，加入培养基（含10%FBS），接种于培养瓶，24 h后换液，每48 h换液，观察。

1.2.2 子宫内膜细胞炎症模型的建立 接种于培养板中处于对数生长期的细胞，随机分为两组，正常对照组和炎症模型组，每组设置平行4个样本。根据文献[3]所确定LPS最佳浓度，炎症模型组加入浓度为100ng/mLLPS，正常对照组加入等量培养液，收集细胞培养液，离心取上清液进行ELISA分析。

1.2.3 盆炎灌肠方对子宫内膜细胞炎症模型的影响 将培养板中处于对数生长期的子宫内膜细胞，随机分为3组，正常对照组、炎症模型组、实验组，每组均设置平行4个样本。炎症模型组如上述方法添加LPS诱导剂，实验组加入100 ng/mL LPS诱导剂和5 mg/mL的盆腔灌肠方，正常对照组加入等量的培养液（含10%FBS）。培养72 h后，收集各组的细胞培养上清液，1 000 r/min离心后，进行IL－1β、TNF－α的检测。取单层细胞进行 TNF－α、IL－1β mRNA的检测，RT－PCR法测定其表达。取单层细胞进行核蛋白提取，Western blot法检测NF－κB p65的蛋白表达。

1.2.4 统计方法 采用SPSS 17．0统计软件包进行分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，单因素设计计量资料的组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较时，若方差齐采用LSD法，若方差不齐采用Dunnett’sT3法，重复测量设计的计量资料采用重复测量方差分析，P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 子宫内膜细胞光镜观察的结果 贴壁生长的腺上皮细胞呈蝌蚪形或多角形（见图1A），3 d后，长成旋涡状排列的致密单层细胞集落（见图1B）。7 d时，细胞伸长，细胞集落扩大并相互融合成片（见图1C），传2～3代后腺上皮细胞逐渐减少消失，间质细胞明显增生，间质细胞显微镜下可见两种形态:呈多角形或星形（见图1D，图1E），2～3次传代后，细胞伸长成梭形（见图1F）；另一种为梭形细胞，长期连续培养后，细胞延伸呈梭形，相互平行排列成束，密度大的区域细胞聚集成堆（见图1G）。

2.2 子宫内膜细胞炎症模型的建立 正常对照组子宫内膜细胞在培养期间持续分泌IL－1β、TNF－α，但含量较低，且分泌IL－1β、TNF－α随时间变化差异无统计学意义（P＞0．05）；0 h及24 h时间段炎症模型组分泌IL－1β、TNF－α未见明显升高，与同时间段正常对照组差异无统计学意义（P＞0．05）；48 h及72 h时间段炎症模型组分泌IL－1β、TNF－α显著升高，明显高于同时段正常对照组（P＜0．05）；且在72 h时炎症模型组IL－1β、TNF－α达到最高，明显高于0、24、48h时IL－1β、TNF－α（P＜0．05），提示造模成功。见表1～2。

表1 LPS对人子宫内膜细胞培养液IL-1β浓度的影响（±s）Tab.1 Effect of LPS on the IL-1β concentration in endometrium cell culture fluid（±s）pg/mL

表1 LPS对人子宫内膜细胞培养液IL-1β浓度的影响（±s）Tab.1 Effect of LPS on the IL-1β concentration in endometrium cell culture fluid（±s）pg/mL

注：与正常对照组0 h比较，*P＜0．05；与同时间段正常对照组比较，#P＜0．05；与炎症模型组72 h比较，▲P＜0．05。

组别 时间0 h 24 h 48 h 72 h正常对照组581．40±11．44592．03±12．35 579．37±15．39 599．67±9．16炎症模型组585．03±6．16#603．43±5．68#1 033．02±28．52*#▲1315．23±16．08*#

表2 LPS对人子宫内膜细胞培养液TNF-α浓度的影响（±s）Tab.2 Effect of LPS on TNF-α concentration in endometrium cell culture fluid(±s)pg/mL

表2 LPS对人子宫内膜细胞培养液TNF-α浓度的影响（±s）Tab.2 Effect of LPS on TNF-α concentration in endometrium cell culture fluid(±s)pg/mL

注：与正常对照组0 h比较，*P＜0．05；与同时间段正常对照组比较，#P＜0．05；与炎症模型组72 h比较，▲P＜0．05。

组别 时间0 h 24 h 48 h 72 h正常对照组 63．73±0．82 62．79±0．65 62．86±1．89 65．28±0．24炎症模型组 63．89±0．22#65．23±0．15#229．90±4．98*#▲289．30±3．08*#

图1 子宫内膜细胞形态Fig.1 The morphology of endometrium cell

2.3 盆炎灌肠方对子宫内膜细胞炎症模型的影响

2.3.1 盆炎灌肠方对子宫内膜细胞炎症模型分泌细胞因子的影响 在盆炎灌肠方的作用下，实验组细胞分泌IL－1β、TNF－α明显低于炎症模型组，差异有统计学意义（P＜0．05），与正常对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05），可见盆炎灌肠方有明显的抑制炎性因子分泌的作用。见表3。

表3 盆炎灌肠方对人子宫内膜细胞培养液IL-1β、TNF-α的影响（±s）Tab.3 Effect of enema prescription for pelvic inflammatory disease on IL-1β and TNF-α concentration in endometrium cell culture fluid（±s）ng/L

表3 盆炎灌肠方对人子宫内膜细胞培养液IL-1β、TNF-α的影响（±s）Tab.3 Effect of enema prescription for pelvic inflammatory disease on IL-1β and TNF-α concentration in endometrium cell culture fluid（±s）ng/L

注：与正常对照组比较，*P＜0.05；与炎症模型组比较，▲P＜0.05。

组别 IL-1β TNF-α正常对照组 604.97±11.00 75.44±13.88炎症模型组 1292.26±7.99* 293.62±19.49*实验组 672.00±10.27▲96.21±13.02▲

2.3.2 盆炎灌肠方对子宫内膜细胞炎症模型IL-1β、TNF-α的mRNA表达的影响 半定量RT-PCR电泳灰度值比较可见，炎症模型组细胞中IL-1β、TNF-α的mRNA表达水平明显高于正常对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；实验组细胞中IL-1β、TNF-α的mRNA表达水平低于炎症模型组，差异有统计学意义（P＜0.05），且与正常对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见图2、表4。

图2 各组目的基因扩增产物电泳图Fig.2 Electrophoregram of target gene amplification product in each group

2.3.3 盆炎灌肠方对子宫内膜细胞炎症模型NF-κB p65蛋白表达的影响 蛋白条带灰度值比值比较，炎症模型组细胞核中NF-κB p65蛋白的表达水平明显高于正常对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；实验组细胞核中NF-κB p65蛋白的表达水平低于炎症模型组，差异有统计学意义（P＜0.05），且与正常对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见图3、表5。

表4 RT-PCR检测IL-1β、TNF-α的mRNA表达量的灰度值统计学分析（±s）Tab.4 Statistic analysis of gray value of the expression of IL-1β,TNF-α mRNA for RT-PCR（±s）

表4 RT-PCR检测IL-1β、TNF-α的mRNA表达量的灰度值统计学分析（±s）Tab.4 Statistic analysis of gray value of the expression of IL-1β,TNF-α mRNA for RT-PCR（±s）

注：与正常对照组比较，*P＜0.05；与炎症模型组比较，#P＜0.05。

组别 IL-1β mRNA TNF-α mRNA正常对照组 0.530±0.0.15 0.472±0.018炎症模型组 0.807±0.009* 0.745±0.017*实验组 0.540±0.013#0.490±0.015#

图3 Western blot法检测盆炎灌肠方对子宫内膜细胞炎症模型NF-κB p65蛋白的表达Fig.3 Effects of enema prescription for pelvic inflammatory disease on the expression of NF-κB p65 in inflammation model of endometrial cell

表5 NF-κB p65蛋白条带灰度值分析结果（±s）Tab.5 Results of statistic analysis for gray value of NF-κB p65 protein stripe（±s）

表5 NF-κB p65蛋白条带灰度值分析结果（±s）Tab.5 Results of statistic analysis for gray value of NF-κB p65 protein stripe（±s）

注：与正常对照组比较，*P＜0.05；与炎症模型组比较，#P＜0.05。

组别正常对照组炎症模型组实验组NF-κB p65蛋白1.49±0.29 2.18±0.13* 1.23±0.01#

3 讨论

目前对PID的研究，使用的实验模型有动物模型、细胞模型。其中动物模型，在造模过程中其感染因素、致病菌、病理特点等都与人类PID相似，被广泛使用，但由于种属差异，其应用仍存在一定的局限性。本实验以LPS作为刺激物诱导人子宫内膜细胞制作炎症反应模型，将炎症反应从体内移到体外，可以排除体内多种因素的干扰，能更好地反映炎症发生时细胞产生的形态学变化及分子、基因水平上发生的变化[4]，为药物作用实验奠定了基础。

盆炎灌肠方由红藤、败酱草、三棱、莪术、丹参、水红花子、川楝子、延胡索组成。方中红藤、败酱草两药功善清热解毒、祛瘀散结，均为治疗肠痈腹痛的要药，以除致病之因，共为君药。三棱、莪术既入血分，又入气分，两者均善于行气破血、消积止痛，为经典的活血祛瘀散结的药对，两药配伍,破血逐瘀之力极佳，散一切血瘀气结。再配合“功同四物”、活血化瘀、破血消积作用强的丹参，三者合用，共为臣药，使瘀去而新生。川楝子善于行气止痛，延胡索善于活血行气止痛，两者相须为用，使气行血畅，疼痛自止。水红花子功善化痞散结，清热止痛，三药并用，共为佐使药，不仅助君药、臣药清热、散结，且通畅气机而止痛。综观全方，融清热利湿、活血化瘀法于其中，选药得当，为治疗盆腔炎性疾病的良方。

现代药理研究证实，盆炎灌肠方中的多味中药具有抗炎作用。Rmoker等[5]发现红藤茎藤煎液对金黄色葡萄球菌、乙型链球菌等有较强的抑制作用；败酱草制剂在治疗妇科炎症（阴道炎、宫颈炎、慢性盆腔炎及宫颈糜烂等）方面具有一定疗效[6]。丹参中的丹参酮通过抑制炎性细胞因子的表达从而减轻炎症反应[7]。水红花子水煎剂对志贺氏痢疾杆菌和福氏痢疾杆菌具有抑制作用[8]。郑蓓蓓等[9]研究表明,川楝子、延胡索有明显的抗炎作用,其抗炎作用机制部分在于抑制前列腺素E2（PGE2）、一氧化氮（NO）、白介素-6（IL-6）的产生，抑制PMN产生氧自由基。

在炎症反应复杂的网络系统中，内皮细胞、单核细胞受到刺激后活化，分泌出多种细胞因子和炎性介质，继而激活一些炎性细胞的NF-κB，促使单核细胞不断分泌IL-1、TNF-α等细胞因子，从而导致炎症反应的扩大。细胞因子已被证实与急慢性炎症疼痛的产生密切相关[10]。IL-1β和TNF-α都是激活免疫和炎性细胞重要的促炎性细胞因子，在炎症反应过程中起促进作用，通过免疫上调和促进炎症介质的活性而加重子宫内膜的炎症反应和组织损伤。IL-1既是机体组织受到损伤和发生炎症反应时作出急性反应的关键介质[11]，又是启动抗菌炎性反应的关键细胞因子之一[12]。TNF-α既是启动炎症的重要细胞因子，还与腹膜粘连的形成有着显著性联系，是腹膜粘连形成的可靠的生物学标志[13]，可刺激成纤维细胞增殖ECM增多，同时通过细胞因子调节网络的协同作用参与促进纤维化[14]。

NF-κB是一种多效性转录因子，作为信号传导途径的枢纽，与炎症、免疫、肿瘤的发生发展、细胞调亡的调节等有密切联系，具有多种调节作用，可以与多种基启动子部位κB位点发生特异性的结合从而促进其转录表达，在炎症反应的细胞因子网络调控中起重要作用。据研究报道[15]，在呼吸道、肠道炎症发生时，LPS和白细胞呼吸暴发过程产生的活性氧均可通过激活腺上皮细胞NF-κB引起IL-1β、TNF-α转录增多,二者又是NF-κB的激活剂，从而引起中性粒细胞、淋巴细胞NF-κB激活,通过TNF-α、IL-1β正反馈作用,NF-κB的激活进一步增加,形成级联反应，从而使炎症反应放大及延续。

本研究表明，子宫内膜细胞炎症模型中TNF-α和IL-lβ的含量上升，IL－1β、TNF-α mRNA及NF-кB p65的表达也明显增加，NF-κB信号通路被激活，促进了炎性介质的释放，促使IL-1β、TNF-α转录增多，NF-кB p65与趋化性细胞因子具有双重性，一方面,趋化白细胞到达炎症部位,加强白细胞对病原菌的杀灭；另一方面,大量的趋化性细胞因子则导致过度的炎症反应,造成组织损伤，两者增多同时可以激活NF-κB，形成级联反应,从而使子宫内膜炎症反应放大、延续。盆炎灌肠方可抑制NF-кB p65的表达，从而阻断NF-κB信号通路活化，使子宫内膜细胞炎症模型中的IL-1β、TNF-α mRNA的表达水平明显下降，与正常子宫内膜细胞中IL-1β、TNF-α mRNA表达水平基本均等，由此推测盆炎灌肠方降低了细胞中IL-1β、TNF-α mRNA的转录,减少了对NF-κB的进一步活化,从而使受NF-κB调控的炎症介质IL-1β、TNF-α产生减少,减轻细胞坏死以及细胞坏死所致邻近组织继发性损伤，发挥其抗炎作用治疗PID后遗症。

本研究中采用盆炎灌肠方培养液直接作用于子宫内膜细胞，可以直接检测药物对机体局部功能指标,能够反映药物中在可吸收部位的直接作用，且操作简单易行，但还存在局限性，未能体现中药灌肠给药途径的意义，笔者会在今后继续研究。

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Experimental study on anti-inflammatory effects of enema prescription for pelvic inflammatory disease in inflammatory model of endometrium cell

ZHAO Lin,WANG Ya-nan,SONG Dian-rong
（Department of Gynecology,The Second Affiliated Hospital of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 300150,China）

[Objective]To study the anti-inflammatory effects of enema prescription for pelvic inflammatory disease in an inflammatory model of endometrium cell.[Methods]The model of inflammatory endometrium cell was established by inducing endometrium cell with lipopoly-sacharide.They were randomly divided into three groups:normal cell control,inflammatory model and experimental group.After culture for 72 hours,the concentration of IL-1β and TNF-α,their expression of mRNA and the protein expression of NF-κB p65 were detected.[Results]The enema prescription for pelvic inflammatory disease can effectively inhibit the secretion of IL-1β,TNF-α and the expression of their mRNA in the model group.It can also effectively inhibit the expression level of NF-κB p65 in the cellular nucleus of model group.[Conclusion]The enema prescription of pelvic inflammation has obviously anti-inflammatory effect in the model of pelvic inflammatory disease and it may be related to NF-κB pathway.

enema prescription for pelvic inflammatory disease;endometrium cell;inflammation model;IL-1β;TNF-α;NF-κB

R285.5

A

1672-1519（2014）11-0681-05

2014-05-18）

（本文编辑：马 英，马晓辉）

10.11656/j.issn.1672-1519.2014.11.12

天津市中医药管理局中医、中西医结合科研基金项目（11056）。

赵 琳（1987-），女，硕士研究生，住院医师，主要研究方向为中医妇科学。

宋殿荣，E-mail:songdr58@126.com