SELEX技术筛选甲基苯丙胺适配子

陆鑫蔚，胡小龙，张玉荣，孙美琪，曹芳琦，黄琴蓉，曾立波

（1.中国医药工业研究总院上海医药工业研究院 创新药物与制药工艺国家重点实验室，上海200437；2.上海市公安局物证鉴定中心 上海市现场物证重点实验室，上海200083）

甲基苯丙胺（methamphetamine）俗称冰毒，是一种依赖性极高的精神活性物质，是国家严控的一类精神药品和麻醉药品（国食药监安2005年481号文件）。目前，国际上苯丙胺类物质的滥用呈不断上升趋势。专家们预测，苯丙胺类兴奋剂将成为21世纪最广泛滥用的药物[1]。由于现在研发的甲基苯丙胺胶体金标单抗试剂盒都会有不同程度的交叉反应，所以本课题旨在研究针对甲基苯丙胺特异性结合的适配子，为研发高度特异性甲基苯丙胺适配子试剂盒奠定基础。

核酸适配子（Aptamer）是体外化学合成并能与靶分子特异性结合的单链DNA或RNA寡核苷酸分子。针对结构相似的物质，适配子的特异性及亲和性都优于抗体。SELEX（配体指数增强系统进化技术）是Tuerk和Gold[2]在1990年分别研究的一种新的组合化学技术，其应用大容量的随机寡核苷酸文库，并结合体外PCR扩增技术，以指数级富集与靶分子特异结合的寡核苷酸，经过多轮筛选，获得高亲和力、特异性强的寡核苷酸适配子[3]。目前，该技术已被成功地用于筛选各种靶物质的结合序列，包括小分子[4]、蛋白质[5]、无机物[6]等等。筛选到的小分子物质的适配子包括药物（可卡因[7]）、毒物（蛤蚌毒素[8]）、农药（毒死蝉[9]）等的适配子。小分子毒品毒物的适配子筛选难度较大，目前报道较少，所以本研究旨在运用SELEX技术从合成的随机单链DNA（ssDNA）文库中筛选到针对甲基苯丙胺的特异性适配子，为小分子毒品毒物适配子的筛选提供一个技术平台。

1 材料和方法

1.1 材料

体外设计和合成76 bp的随机ssDNA文库：5’-GCG GAT GAA GAC TGG TCT-N40-GCC CTA AAT ACG AGC AAC-3’，上游引物 F：5’-FAM-GCGGATGAAGACTGGTCT-3’，下游引物 R：5’-Biotin-GTTGC TCGTATTTAGGGC-3’。文库和引物合成（上海英骏生物技术有限公司）。试剂中所用胶纯化试剂盒、链霉亲和素磁珠、溴化氰活化琼脂糖、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）、N-乙基-N-（二甲氨基丙基）碳二亚胺（EDC）都购于Sigma公司；2×PCR mix（天根生物有限公司）；甲基苯丙胺完全抗原（杭州隆基生物技术有限公司）；DNA序列测定（上海英骏生物技术有限公司）。

1.2 仪器

Veriti PCR仪（美国AB公司）；全自动凝胶成像分析仪（英国Syngene公司）；Tanon电泳仪（广州誉维生物科技仪器有限公司）；振荡培养箱（SHEL LAB）、BI-3000。型表面等离子体共振仪（Biosensing Instrument Inc）。

1.3 方法

1.3.1 甲基苯丙胺完全抗原与溴化氰活化琼脂糖偶联

称2 g溴化氰活化琼脂糖，活化后与5 mg甲基苯丙胺完全抗原孵育过夜，用0.1M NaHCO3（含0.5 M NaCl）洗涤，离心半径 13.5 cm，3 000 r/min 离心 5 min，弃上清。用0.2M甘氨酸进行封闭过夜。封闭后用结合缓冲液（20mmol/LTris-HCl，137mmol/L NaCl，5mmol/L KCl，2mmol/L CaCl2， 1mol/L MgCl2）洗涤，洗涤完装入亲和层析柱中。按如上方法制备含BSA的亲和层析柱作为阴性柱。

1.3.2 SELEX筛选

（1）结合：将200 pmol/L的ssDNA库95℃热变性10 min，迅速冷却到0℃，5 min之后将ssDNA文库先加入阴性柱进行反筛选，收集液体再加入含甲基苯丙胺的柱子，用Binding Buffer洗3次。

（2）洗脱：加入 100 μg/mL 甲基苯丙胺进行洗脱，收集洗脱液进行PCR。

（3）PCR反应：PCR反应体系：ssDNA模板23 μL，上游引物1μL，下游引物1μL，2×PCR缓冲液25 μL。PCR反应条件：95℃预变性3min，25个循环的95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，最后72℃延伸3 min。

（4）纯化：将PCR产物走2%的琼脂糖凝胶，把想要的胶切下并纯化。

（5）ssDNA次级库的合成：将纯化后的带生物素的dsDNA与链霉亲和素磁珠在1×B&W缓冲液（pH7.5，10mM Tris-HCL，1mM EDTA，2M NaCl） 室温条件下结合30min左右。用1×B&W缓冲液洗涤2～3次，加入 150 mM NaOH 37℃孵育 15 min，使 dsDNA解链，用磁力架分离，使含生物素的一条ssDNA留在链霉亲和素磁珠上，而另一条不带生物素的ssDNA用于下一轮筛选的次级文库。

（6）重复以上步骤10轮。

1.3.3 SPR检测结合率

（1）CM5传感片的包被：2 mM巯基乙胺1 mL滴在金膜上孵育12 h，再将15 mM NHS和75 mM EDC（新鲜配制）与6 mg/mL CM-dextran进行混合并滴在金膜表面3 h。

（2）结合率的测定：流速控制在 40 μL/min，先通过一段连续的结合缓冲液冲洗直至基线稳定。当基线稳定后，注射含0.4M EDC和0.1M NHS的氨基偶联试剂200μL，活化CM5传感片上的羧基。将甲基苯丙胺完全抗原用结合缓冲液稀释至5mg/mL，注射该溶液200μL，由于甲基苯丙胺完全抗原上BSA的氨基与传感片上活化的酯基发生氨基偶联反应而使甲基苯丙胺被固定在传感片上。注射200μL的1M乙醇胺溶液，用来封闭金膜上尚未发生偶联反应的酯基。最后注入200μL的结合缓冲液除去非特异吸附的乙醇胺。将第1轮到第10轮的ssDNA分别注入SPR仪中，与金膜表面上的甲基苯丙胺作用一段时间，用20mM的NaOH再生液使基线恢复，实时采集响应信号。重复以上相同步骤来检测BSA（阴性对照）是否结合适配子。

1.3.4 克隆和测序

最后一轮筛选的产物经PCR扩增纯化后，连接到pUC-T载体上，在转化到感受态细胞DH5α中，通过培养、蓝白斑筛选，挑出10个白色菌落，摇菌，对菌液提取质粒进行电泳验证，挑出10个阳性克隆进行序列测定（上海英骏生物技术有限公司测定）。

1.3.5 适配子结构预测与分析

将测序获得的适配子序列用Clustal X和MFOLD[10]软件分析适配子一级结构的同源性，并进行二级结构的预测。

2 结果

2.1 PCR条件优化结果

结果发现，不同的退火温度、循环次数、模板量均会影响ssDNA扩增为dsDNA的PCR扩增效果，在每一轮筛选的PCR过程中，都应该经过2%的琼脂糖凝胶电泳确定目的条带最亮，无非特异性扩增的最佳PCR条件后，再大量扩增用于下一轮的筛选。将退火温度分别设为 53℃，55℃，57℃，59℃，61℃时，由图1可见，退火温度为55℃时条带最清晰、明亮，且非特异性少，所以选择55℃为最优退火温度。将每轮PCR产物进行2%的琼脂糖凝胶电泳显示（见图2），在100bp以下均出现预期的单一条带（理论为76bp），条带随着轮数的增加而越来越致密且单一。

图2 第1～10轮PCR产物的2%琼脂糖凝胶电泳图谱

2.2 SPR检测结合率的结果

用SPR检测每轮ssDNA文库与甲基苯丙胺完全抗原的亲和力，阴性对照使用BSA检测每轮ssDNA文库，图3可见，RU值从第1轮的88.3上升到第8轮的110.9，呈上升趋势。自第8轮之后的两轮的RU值无明显变化，说明适配子与甲基苯丙胺完全抗原的结合亲和力达到饱和。BSA的阴性对照显示每轮ssDNA文库与BSA完全没有响应，说明我们筛选出的适配子只和甲基苯丙胺结合，不和BSA结合。

图3 SPR测定每轮ssDNA和甲基苯丙胺完全抗原的结合率

2.3 甲基苯丙胺完全抗原适配子的测序结果和二级结构的分析

经分析，有10个克隆子测序成功。如表1所示，A05、B09-891、E06-924 和 H11 的序列是一致的，B03和F07-937的序列是一致的，G06和G11的序列是一致的。

表1 适配子测序结果

图4 甲基苯丙胺适配体二级结构

通过软件预测了5个有活性的适配子的二级结构（见图4），发现这些预测的结构图都含有茎-环结构。可分为两类：第一类为A05，B03和E08，主要是5’端和3’端的固定序列形成了一个大的环状结构，中间随机序列形成了茎-环结构；第二类为E01和G06，主要是5’端和3’端的固定序列分别和随机序列形成了茎-环结构。

3 讨论

适配子是通过SELEX技术筛选出来的一段寡核苷酸序列。它的稳定性、亲和力和特异性都优于抗体；制备适配子可以通过体外筛选，无需免疫动物；变性与复性可逆；无批间差异；可修饰并易于长期保存和室温运输等。一般用于SELEX技术筛选的寡核苷酸链文库有3种：随机RNA文库、经修饰的RNA文库和ssDNA文库。本研究采用的ssDNA文库全长76 bp，中间为40 bp的随机核苷酸序列，由A、G、C、T密码子随机组合，这样可能有440个理论组合，即理论库容量为1015，足以满足筛选适配子的需求。大分子物质如蛋白、细胞等适配子的筛选采用离心、沉淀的方法就可以筛选得到，而小分子物质首先必须将其固定或包被在固相载体上，制成亲和介质后方可进行SELEX筛选。本研究采用小分子的完全抗原进行筛选，利用BSA将小分子固定在亲和层析柱上，克服了小分子难以固定在固相介质的难题，为了去除与固相介质结合和BSA的非特异性反应，我们在每2轮筛选后进行一次反筛选，即用次级文库先与偶联BSA的亲和层析柱结合反应一定时间后，再与偶联甲基苯丙胺完全抗原的亲和层析柱进行筛选，反筛对于从复杂的核酸序列中筛选针对靶分子的特异的适配子价值较大，即降低了筛选背景，又增加SELEX筛选的严谨性，所以进行反筛选是必不可少的。

SELEX筛选第一轮使用的文库为合成的随机寡核苷酸文库，次级文库主要来源于：（1）生物素-链霉亲和素磁珠分离法；（2）不对称PCR法。有报道称，随着筛选轮数增加，不对称PCR得到的产物非特异性明显增加，该法得到的ssDNA文库不够稳定[11]。所以，我们采用了生物素-链霉亲和素磁珠分离法制备次级文库。

经过10轮的筛选，琼脂糖凝胶电泳验证发现，随着轮数的增加，条带越来越清晰明亮，说明适配子的特异性也在逐步提高。通过用SPR测定每轮ssDNA文库和甲基苯丙胺完全抗原的结合率结果显示，结合率从88．3 RU上升到113．7 RU；说明得到了与甲基苯丙胺特异结合的适配子。获得的适配子进行测序，得10个序列，二级结构均为茎-环结构，可能是适配子和甲基苯丙胺结合的结构基础。

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