辛通畅络法对系膜增生性肾炎模型大鼠IL-1、IL-6和细胞外基质的影响

支勇 窦一田 曹式丽

（天津中医药大学第一附属医院，天津 300193）

辛通畅络法对系膜增生性肾炎模型大鼠IL-1、IL-6和细胞外基质的影响

支勇 窦一田 曹式丽

（天津中医药大学第一附属医院，天津 300193）

目的：观察辛通畅络中药复方肾苏Ⅱ对系膜增生性肾炎（MsPGN）模型大鼠肾组织白介素1（IL-1）、白介素6（IL-6）及肾小球细胞外基质（ECM）的影响，探讨中医药防治MsPGN的有效途径。方法：采用抗Thy-1系膜增生性肾炎大鼠模型，以中药复方肾苏Ⅱ为治疗药物，贝那普利为对照药物，于治疗6周末，分别观察各组大鼠肾组织IL-1、IL-6和肾小球纤维连接蛋白（FN）、层粘连蛋白（LN）和Ⅳ型胶原（ColⅣ）表达的变化情况。结果：治疗6周末，中药组在抑制MsPGN大鼠肾组织IL-1、IL-6表达，减少肾小球FN、LN、ColⅣ表达量等方面显示疗效优势，且均明显优于西药组。结论：以辛通畅络立法的中药复方肾苏Ⅱ，具有减轻MsPGN模型大鼠肾小球ECM积聚，改善肾小球硬化的作用。

系膜增生性肾炎 辛通畅络 中药复方 白介素 肾小球细胞外基质 实验研究

系膜增生性肾小球肾炎（MsPGN）是临床常见的肾小球疾病的病理类型，在我国原发性肾病综合征中MsPGN高达30%[1]，成为导致肾小球硬化进而发展为晚期肾功能衰竭的主要疾病。MsPGN的组织学特征为肾小球系膜细胞的异常增生和系膜基质的病理性积聚。在MsPGN的病变过程中，细胞因子起到重要作用，如IL-1、IL-6等。本研究采用抗大鼠胸腺细胞抗体（Anti-Thy-1）诱发MsPGN大鼠模型，观察肾苏Ⅱ对肾组织IL-1、IL-6和肾小球基质成分FN、LN和ColⅣ表达的影响。

1 实验材料

1.1 实验动物健康雄性日本大耳白兔4只，体重（1250± 250）g，普通级；远交系健康雄性SD大鼠40只[10周龄，体重（150±10）g]，幼龄SD大鼠10只（4周龄），SPF/VAF级。以上实验动物均由中国医学科学院放射医学研究所动物中心提供（合格证号：SCXK津2005-0001）。

1.2 实验试剂完全福氏佐剂与不完全福氏佐剂（Sigma公司）；IL-1、IL-6试剂盒（尚柏生物医学技术北京公司）；FN、LN、ColⅣ试剂盒（Labvision公司）。

1.3 实验药物肾苏Ⅱ，处方：柴胡12g，黄芩10g，生黄芪30g，当归10g，女贞子15g，泽兰15g，水蛭10g，细辛3g，煎煮浓缩（含0.85g生药/mL），装瓶密封，置4℃冰箱保存备用。药物购自天津中医药大学第一附属医院中药房，加工由天津中医药大学药厂协助完成。苯那普利：瑞士诺华制药有限公司产品，规格：10mg/片，批号：06031404。

2 实验方法

2.1 动物分组40只大鼠适应性饲养1周后，按体重分层随机分为正常组、模型组、西药组和中药组，每组10只。

2.2 模型复制参考文献[2-4]复制抗Thy-1系膜增生性肾炎大鼠模型。大鼠30只，经尾静脉注射兔抗鼠胸腺细胞抗体血清（ATS），每周1次，连续3周，初次注射ATS（1∶32）1.0mL/只，加强注射ATS（1∶16）1.0mL/只。

2.3 给药方法自MsPGN模型制备第1天起，中药组每日1次以3.5g/100g体重灌服肾苏Ⅱ，西药组每日1次以0.33mg/100g体重灌服贝那普利混悬液，正常组与模型组每日1次灌服等量生理盐水，共进行6周。实验全程各组均给予普通饲料喂养，自由进水。实验过程中因灌胃误入气管，中药组于治疗第4周初死亡1只，其他各组实验过程中无动物死亡。

2.4 标本采集于给药后第6周末杀检全部大鼠，打开腹腔，摘取肾脏，迅速剪取部分肾组织放入冻存管并置于液氮中冻存，用于肾组织IL-1、IL-6检测；另再取部分肾脏组织置于10%福尔马林中固定，用于肾小球FN、LN、ColⅣ检测。

2.5 检测指标采用双抗体夹心ELISA法检测肾组织IL-1、IL-6。采用免疫组化ABC法检测肾小球FN、LN、ColⅣ。采用HMIAS-2000高清晰度彩色病理图像分析系统，于400倍高倍镜下，每个标本随机选取10个视域，测量肾小球FN、LN、ColⅣ表达的阳性反应物信号的面积比（阳性信号物质占肾小球体的面积百分比），分析各组大鼠肾小球FN、LN、ColⅣ表达的相对水平，评价各组肾小球ECM增殖程度。

2.6 统计学方法实验数据应用SPSS13.0统计软件进行分析，各组实验数据以（±s）表示，对实验数据进行单因素方差分析，检验结果以P＜0.05为有统计学意义。

3 实验结果

3.1 各组大鼠肾组织IL-1、IL-6的表达实验结果显示，给药6周末，模型组、西药组、中药组大鼠肾组织IL-1、IL-6表达均较正常组明显增加（P＜0.01，P＜0.05）；西药组、中药组明显低于模型组（P＜0.05，P＜0.01）；中药组明显低于西药组（P＜0.05）。见表1。

表1 各组大鼠给药6周后肾组织IL-1、IL-6的表达（±s）pg/mL

表1 各组大鼠给药6周后肾组织IL-1、IL-6的表达（±s）pg/mL

注：与正常组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与西药组比较，△P＜0.05。

组别动物数IL-1IL-6正常组1068.76±43.11270.00±118.64模型组10西药组10213.21±180.76**#499.90±245.99**#中药组9171.58±113.34*##△325.46±193.05*##△291.21±189.23**523.71±167.73**

3.2 各组大鼠肾小球FN、LN、ColⅣ的表达量比较实验结果显示，给药6周末，模型组、西药组、中药组大鼠肾小球FN、LN、ColⅣ的表达量较正常组不同程度增加（P＜0.05，P＜0.01）；其中模型组的表达量最高，中药组明显低于模型组（P＜0.01）与西药组（P＜0.05，P＜0.01）。见表2。

表2 各组大鼠给药6周后肾小球FN、LN、ColⅣ的表达量比较（±s）%

表2 各组大鼠给药6周后肾小球FN、LN、ColⅣ的表达量比较（±s）%

注：与正常组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与西药组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。

组别动物数FNLN ColIV正常组100.37±0.140.72±0.221.18±0.12模型组10西药组102.60±0.42**##中药组91.48±0.12*##△△4.84±0.33**7.92±0.89**2.17±0.42**##5.47±0.68*#1.06±0.35*##△△1.89±0.55**##△6.56±1.50**

4 讨论

MsPGN以肾小球系膜细胞（MsC）的异常增生和细胞外基质（ECM）的病理性积聚为特征。肾小球系膜细胞是系膜区分泌合成ECM的主要细胞，ECM的过度生成和积聚是MsPGN病变的关键机制。本实验中MsPGN模型组大鼠肾小球FN、LN、ColⅣ等ECM成分的表达量显著增加，表明肾小球ECM的大量合成与积聚是导致MsPGN，并发展形成肾小球硬化的重要环节。针对此环节，通过抑制系膜细胞的异常增生，进而减少ECM的大量合成，应该是防治MsPGN的有效手段。

IL-1、IL-6是MsPGN中参与免疫调节和介导炎症反应的细胞因子，同时也是重要的系膜细胞增殖促进因子。IL-1对系膜细胞的增殖和产生ECM具有促进作用，而且系膜细胞本身也可通过自分泌方式产生具有生物活性的IL-1并表达其受体。Werber等[5]研究发现在免疫复合物性肾炎大鼠肾小球系膜细胞的IL-1mRNA表达量比正常大鼠增加2～3倍，表明免疫复合物性肾炎大鼠肾小球系膜细胞能够持续分泌大量的IL-1，刺激系膜细胞增殖及大量合成ECM。IL-6是促进系膜细胞增殖和产生ECM的另一重要细胞因子，也是系膜细胞自分泌的调节因子。正常肾脏能产生微量的IL-6并表达IL-6受体，而当肾小球系膜细胞受到病理因素的刺激后分泌IL-6异常增多，与受体结合刺激系膜细胞增殖，促进ECM的大量合成与积聚。如Horii等[6]研究显示MsPGN的系膜细胞能分泌IL-6，并被IL-6所作用而进一步增殖。由于IL-1、IL-6是具有促进系膜细胞增殖作用的细胞因子，因此通过抑制IL-1、IL-6的表达来阻抑系膜细胞增殖及ECM的合成可成为防治MsPGN的有效途径[5，7]。

中医学认为络脉是气血运行通道，亦是病邪传变途径，具有易瘀易滞、易积成形的病理特点。肾为藏精贮液之脏，又为利水排毒之官，肾脏络脉畅通、气血充盈是其生理功能的前提，而肾气虚弱作为慢性肾脏病的内在病理基础，与瘀血、湿浊、热毒、外邪等病理因素相互影响，久病入络，致肾之精血虚损，肾络郁滞，故肾络枢机不利，因虚致实，肾络郁滞是MsPGN等多种慢性肾脏病的共同病理基础。肾苏Ⅱ是以“枢机不利，肾络郁滞，虚实错杂”为MsPGN病机关键，形成以“标本兼治、辛通肾络”为法的中药复方制剂。方中柴胡、黄芩畅达三焦，枢转气机；黄芪、当归益气补血，扶正理虚；细辛、水蛭辛通畅络，化瘀消滞。诸药协同，疏导调节，养脏和络，促进肾络气血调畅。应用本方干预MsPGN大鼠模型，结果显示肾苏Ⅱ能够显著降低MsPGN大鼠肾组织IL-1、IL-6的表达量，同时减少肾小球FN、LN、ColⅣ等ECM成分的合成，减轻肾小球系膜基质增生。通过上述IL-1、IL-6的促系膜细胞增殖及ECM增生的作用机制，我们推断肾苏Ⅱ防治MsPGN的机理可能是通过抑制MsPGN大鼠肾组织IL-1、IL-6的生成，减轻其对系膜细胞增殖的病理性作用，进而减少系膜细胞合成FN、LN、ColⅣ等ECM成分，达到阻抑肾小球系膜增生，防治肾小球硬化的效果。

[1]叶任高，主编.中西医结合肾脏病学.北京：人民卫生出版社，2003：229

[2]Nomura K，Liu N，Nagai K，et al.Roles of coagulation pathway and factor Xa in rat mesangioproliferative glomerulonephritis.Lab Invest，2007，87（2）：150

[3]刘静芳，温进坤，严霞，等.抗胸腺细胞血清法诱发大鼠系膜增殖性肾炎模型.中国病理生理杂志，1999，15（3）：274

[4]Shinosaki T，Notoya M，Nomura Y，et al.Glomerular epithelial cell injury accelerates the progression of antibody -induced mesangial proliferative nephritis.Exp Nephrol，2002，10（4）：245

[5]Werber HI，Emancipator SN，Tykocinski ML，et al.The interleukin 1 gene is expressed by rat glomerular mesangial cells and is augmented in immune complex glomerulonephritis.J Immunol，1987，138（10）：3207

[6]Horii Y，Muraguchi A，Iwano M，et al.Involvement of IL -6 in mesangial proliferative glomerulonephritis.J Immunol，1989，143 （12）：3949

[7]Shima Y，Iwano M，Yoshizaki K，et al.All -trans -retinoic acid inhibits the development of mesangial proliferative glomerulonephritis in interleukin -6 transgenic mice.Nephron Exp Nephrol，2005，100（1）：54

R692.310.5

A

1672-397X（2014）01-0075-02

支勇（1974-），男，医学博士，主治医师，从事中西医结合治疗肾脏疾病的临床与基础研究。

曹式丽，shilicao@126.com

2013-09-26

编辑：吴宁

国家自然科学基金项目（30772808）