探针熔解曲线技术检测结核杆菌耐药的研究

孙炳奇* 张 娟孙 娇张 婷

（1 沈阳市胸科医院结核病实验室，辽宁 沈阳 110044；2 厦门大学生命科学学院，福建 厦门 361102）

探针熔解曲线技术检测结核杆菌耐药的研究

孙炳奇1* 张 娟1孙 娇1张 婷2

（1 沈阳市胸科医院结核病实验室，辽宁 沈阳 110044；2 厦门大学生命科学学院，福建 厦门 361102）

目的评价探针熔解曲线技术检测结核杆菌耐药效果。方法利用探针熔解曲线技术对46例涂阳肺结核患者的痰标本进行异烟肼和利福平耐药检测，以传统罗氏药敏试验为金标准，对探针熔解曲线技术的检测效果进行评价。结果在46例菌株中，用探针熔解曲线进行异烟肼耐药基因检测，与罗氏药敏的符合率为91.3%，进行利福平耐药基因检测，符合率为84.8%。结论探针熔解曲线检测异烟肼和利福平的耐药性与罗氏药敏方法具有很好的一致性，具有简便快速，灵敏度高，特异性好的优点，对临床及时准确进行抗结核治疗具有重要意义。

探针熔解曲线；异烟肼；利福平；耐药

本研究采用探针熔解曲线技术分别检测异烟肼（isoniazid，INH）和利福平（rifampicin，RFP）的耐药情况，并与传统罗氏培养进行对比，探讨其在药敏检测中的临床应用价值。

1 材料与方法

1.1 样本与试剂

选取罗氏培养生长阳性菌株46例，包括11例INH和RPF均敏感菌株，21例耐多药菌株，5例单耐INH和9例单耐RFP菌株。Bio-Rad CFX96实时PCR扩增仪（美国伯乐），结核分枝杆菌异烟肼耐药突变检测试剂盒（荧光PCR熔解曲线法）和结核分枝杆菌利福平耐药突变检测试剂盒（荧光PCR熔解曲线法）均为厦门致善生物科技有限公司产品[1]。

1.2 罗氏药敏试验

通过观察改良罗氏培养基上结核分枝杆菌菌落的生长速度、色泽等生物学性状，选取适当的菌落，按照《结核病诊断实验室检验规程》[2]，挑取培养基上菌落，用无菌0.5% TWEEN80生理盐水溶解、稀释。与标准麦氏比浊管比浊，即制成1 mg/mL菌悬液，10倍稀释至10-2mg/mL，用灭菌吸管准确吸取0.1 mL菌液分别接种至对照及含药培养基斜面，每管接种量为10-3mg。异烟肼和利福平药物浓度分低高两种浓度，分别是0.2、1 µg/mL；50、250 µg/mL。

1.3 样本制备及核酸提取

取罗氏培养基上生长的结核分枝杆菌，用22SWG标准接种环收集细菌1环，并悬在250 µL结核杆菌DNA提取液中。封口膜封口，99 ℃加热20 min，14000 rpm离心10 min，转移上清到新的1.5 mL离心管，上清即为DNA模板。

1.4 探针熔解曲线技术检测样本

取DNA模板进行PCR反应，利福平组反应参数为UNG 处理50 ℃ 2 min，1个循环；预变性95 ℃ 10 min，1个循环；95 ℃ 15 s，70 ℃ 20 s（每个循环下降1 ℃），76 ℃ 25 s，13个循环；95 ℃ 15 s，57 ℃ 20 s，76 ℃ 25 s，42个循环。熔解分析程序：95 ℃ 2 min，40 ℃ 2 min，45～85 ℃（设置在此阶段每1 ℃采集FAM和TET通道荧光信号），1个循环。

异烟肼组反应参数为UNG 处理50 ℃ 2 min，1个循环；预变性95 ℃ 5 min，1个循环；95 ℃ 10 s，71 ℃ 25 s（每个循环下降1 ℃），75 ℃30 s，10个循环；95 ℃ 10 s，61 ℃ 25 s，75 ℃ 25 s，45个循环。熔解分析程序：95 ℃ 2 min，40 ℃ 2 min，40～80 ℃（设置在此阶段每1 ℃采集FAM和TET通道荧光信号），1个循环。

1.5 与罗氏药敏结果不符的标本均进行测序验证，测序引物分别为INH-ahpC-seq-F：5'-CTTGCCGGAAAGACATGCC-3'，INH-ahpC-seq-R:5'-CGTCA CTGGTGATAGTGGTGA-3'；INH-inhA-seq-F：5'-AGCGCGACATACCTGCTG-3'，INH-inhA-seq-R：5'-CCGATCCCCCGGTTTCC-3'；INH-inhA94-seq-F：5'-CGTTTC ACATCGCACGGG-3'，INH-inhA94-seq-R：5'-GGCTCGGGTCGAAGTCC-3'；INH-katG-seq-F：5'-CGAGACGTTTCGGCGC-3'，INH-katG-seq-R：5'-CCGTCCTT GGCGGTGT-3'；RFP-seq-F：5'-CGGGAGCGGATGACCAC-3'，RFP-seq-R：5'-GCG GTACGGCGTTTCGAT-3'。测序由上海美吉生物医药科技有限公司完成。

1.6 统计学分析

实验数据采用SPSS13.0软件进行统计分析，以绝对浓度法检测结果为判断标准，计算高分辨率探针熔解曲线法的敏感度和特异度，两种方法检测结果的差异性卡方检验判别，两种方法检测结果的一致性用Kappa检验判别。

2 结 果

2.1 探针熔解曲线技术药物敏感性的检测结果

对INH检测的46例菌株中，探针熔解曲线技术药物敏感试验结果与罗氏药物敏感试验结果无统计学显著性差异（P＞0.05）。耐药42例与罗氏药敏结果相符，总符合率为91.3%，Kappa值为0.825，敏感度和特异度分别是88.5%和95.0%；46例对RFP检测结果中，探针熔解曲线技术药物敏感试验结果与罗氏药物敏感试验结果亦无统计学显著性差异（P＞0.05）。39例与罗氏结果相符，总符合率为84.8%，Kappa值为0.680，敏感度和特异度分别是80.0%和93.8%，见表1和表2。

表1 探针熔解曲线对异烟肼和利福平药物敏感性检测结果

表2 探针熔解曲线技术检测耐药的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值和Kappa值

2.2 探针熔解曲线法与测序结果

对INH检测的46例菌株中，4例与结核分枝杆菌耐药检测的“金标准”罗氏药敏结果不相符。基因检测的“金标准”为测序法，将该4例样本的PCR产物进行测序。2例样本的罗氏药敏结果为耐药，探针熔解曲线结果为敏感，测序结果为野生型。1例样本的罗氏药敏结果为敏感，探针熔解曲线结果为耐药，测序结果为katG 315AGC＞GGC。1例样本的罗氏药敏结果为耐药（高浓度耐药），探针熔解曲线为敏感，测序结果为野生型与ahpC启动子区-10C＞T混合，即不均一耐药样本导致探针熔解曲线结果判读失误。ahpC启动子区-10 C＞T的不均一耐药相对不易判读，需要依据经验结合峰型进行判读。

对RFP检测的46例菌株中，7例与结核分枝杆菌耐药检测的“金标准”罗氏药敏结果不相符。基因检测的“金标准”为测序法，将该7例样本的PCR产物进行测序。6例样本的罗氏药敏结果为耐药，探针熔解曲线结果为敏感，测序结果为野生型。1例样本的罗氏药敏结果为敏感，探针熔解曲线结果为耐药，测序结果为rpoB 531 TCGTTG。

测序结果与探针熔解曲线的结果相比，除1份不均一耐药样本探针熔解曲线未成功判读外，结果均一致。

3 讨 论

近年来，结核分枝杆菌耐药性呈逐年上升趋势，异烟肼和利福平作为抗结核一线药物，其耐药性检测对于临床结核病药物治疗具有重要意义。本研究将其用于异烟肼和利福平耐药检测，结果显示与罗氏培养结果的符合率分别为91.3%和84.8%，敏感度为88.5%和80.0%，特异度为95.0%和93.8%，阳性预测值为95.8%和96.0%，Kappa值为0.825

和0.680（Kappa值＞0.81一般表示二者之间具有非常好的一致性，0.61～0.81之间则认为有较好的一致性，＜0.4则代表两试验方法间一致性较差）。与罗氏药敏实验结果不一致样本经测序后证明，除1份不均一耐药样本探针熔解曲线未成功判读外，其余样本的探针熔解曲线结果与测序结果均完全一致。与传统药敏试验相比，探针熔解曲线检测技术在应用于结核分枝杆菌耐药的快速检测时有较高的阳性检出能力，有着良好的特异度和灵敏度，同时更加简便、快速。

[1] 中国防痨协会基础专业委员会《结核病诊断实验室检验规程》[M].北京:中国教育文化出版社,2006:56-57.

[2] 张立群,王云霞,周敏,等.4种不同结核分枝杆菌检测方法对结核病的诊断价值比较[J].中华医院感染学杂志,2010,20(11):1633-1635.

R521

B

1671-8194（2014）13-0076-02

沈阳市科技计划项目（F12-255-1-00）

*通讯作者：E-mail:sunbq2004@163.com