肠鳃类三崎柱头虫再生的研究

王 秋，张学成，李进道

（中国海洋大学海洋生命学院，山东 青岛266003）

半索动物肠鳃类广泛分布于南、北两半球的大洋沿岸以及深海中，迄今发现有60～70种。它们大多数为底内动物，营穴居生活，少数种类为底上动物，栖息于海藻或石块之间。由于形态构造、胚胎发育和繁殖方式的特点，在生物进化研究中占有重要的地位。

再生（Regeneration）是动物和植物中常见的生物学现象，指生物体对失去的结构重新自我修复或代替的过程，生物器官或组织损伤后，保留的部分生长出与原来形态与功能相同的器官或组织的现象。半索动物是一类再生能力较强的动物，其再生和无性生殖较早引起了学者的注意。Spengel在描述肠鳃类一般形态时，首次提到了肠鳃类具有与无性生殖有密切关系的再生现象[1]。Kuwano发现三崎柱头虫（Balanoglossus misakiensis）具有再生现象[2]。Dawydoff以实验的方法比较全面的研究了微小舌形虫（Glossobanlanuss minutus）的再生现象[3]。Gilchrist研究了翼柱头虫（Ptychodera）的双态性（Dimorphism）和无性繁殖[4]。Morton发现柱头虫（Balanoglossusaustrallensis）也存在无性生殖现象[5]。Tweedell将玉钩虫科（Harrimanlidae）科氏长吻虫（Saccoglossuskowalevlevskii）的虫体横切为2段观察它们的再生现象[6]。Petersv指出：翼柱头虫（Ptychodera）、柱头虫（Balanoglossus）和舌形虫（Glossobanlanus）都是以同一模式进行无性生殖[7]。Miyamoto研究了柱头虫（Balanoglossussimodensis）虫体不同断片的再生现象[8]。

1960年，中国海洋大学生命学院（原山东海洋学院生物系）胚胎学教研室李嘉泳教授指导作者开始了三崎柱头虫（Balanoglossusmisakiensis）生殖和发育的研究。1966年因故工作中断。在1980年重新开展三崎柱头虫生殖和发育研究的工作时，多次发现了它们具有再生现象，并做了深入的研究。

1 材料和方法

1.1 样品的采集

1980—1982 年，每年6～10月，在山东省青岛市辛岛湾潮间带采集完整无缺的三崎柱头虫（Balanoglossusmisakiensis），柱头虫用装有海水的广口保温瓶当日带回实验室饲养。

1.2 饲养方法

实验用柱头虫均以直径25cm，高12cm的圆形水槽进行室内饲养，以采集地区的沙质基质铺满水槽底部（厚度约5～6cm）。水槽内砂质基质上自然生长的底栖硅藻和碎屑作为主要饵料，另投入人工培养的三角褐指藻（Phaeodactylumtricornutum）。饲养水温控制在17～20℃。

1.3 实验方法

1980年6 月～1982年6月采集的部分三崎柱头虫在暂养期间发生了自切，在上述培养条件下对自切片段的再生进行了观察，共观察了6条个体。1981年秋～1982年春对113条柱头虫进行了人工手术横切后的再生实验。使用剃刀片（或发缚）对三崎柱头虫做横切手术，横切手术类型和横切部位如下：

A型 自虫体的生殖翼和肝区之间横切为2段。手术时确保虫体后段肝囊的完整。

B型 将虫体横切为3段。Ⅰ段包括吻、领、鳃区及生殖翼；Ⅱ段是肝区部分；Ⅲ段是肝囊以后的肠和肛门。C型 将虫体横切为4段。Ⅰ段包括吻、领、和鳃区；Ⅱ段是鳃区后面的生殖翼部分；Ⅲ段是肝囊；Ⅳ段是肠区和肛门。

切割后的虫体断片饲养方法如上所述，对照个体（4例）与实验个体置于同一条件下饲养。

能够重建全部失去的器官，恢复完整的个体，并且生活习性和生存能力与母体相同的断片视为再生个体，否则视为未再生断片。

2 实验结果

2.1 自切后再生观察

1980年6月28 日采集了1条柱头虫，雌性，体长约40cm，身体细长柔软，消化道内充满沙粒和碎屑，身体表面裹以黏液和沙粒。洞穴呈U字形，深度约15cm，生殖翼不够丰满，采集时气温为25℃，洞穴内水温为24℃，打开洞穴时可以嗅到强烈的碘气味，可能是三碘甲烷气体[CHI3]。在饲养过程中，虫体夜间离开洞穴活动，见光后钻入基质，生殖翼逐渐丰满。8月底采集地自然环境条件下柱头虫的生殖期已过，但是已经达到了产卵前状态的饲养个体没有排卵。9月2日饲养水温提升到25℃，由于升温的刺激，迅速排放了卵子，数小时之内生殖翼中的卵子几乎全部排光。排卵后的虫体于9月3日沿着生殖翼的中后部自切为前、后2个段片。前段包含吻、领、鳃区和生殖翼的一部分，后段包含生殖翼大部、肝囊区、肠区和肛门。缺少吻的后段虽然维持生命状态直到10月初，但是始终不能钻入基质，没有摄食行为，没有出现再生前端器官的迹象，历时近1个月解体。前段从自切到开始摄食和开始钻入基质的时间不足48h，恢复夜间离开洞穴活动，清晨再钻进基质的生活习性。9月底前段生殖翼的后端发生了明显退化，并进行重建（Remodeling）活动。10月底重建的前段生长良好，再生出肝囊和肠，成为完整的个体，生活习性完全恢复了正常，夜出昼伏，摄食积极。后由于室内温度连续下降，虫体活动能力逐渐减弱，钻进基质耗费的时间愈来愈长，12月初室温下降到7℃时，虫体完全失去钻进基质的能力，在基质表面自切为数段，不久即完全死亡。再生虫体体长最终达到母体体长的一半，大约20cm。这条柱头虫在饲养条件下共生活了156d。

1981年7月2 日采集了另一条柱头虫，雄性，体长约35cm。7月4日，虫体在肝囊的后部边沿处自切为2个段片。7月5日，前段又沿着生殖翼的后部发生了自切。7月6日，后部的2个段片死亡。惟有前端的断片可以钻入基质，7月底重建再生了后部的肝囊、肠和肛门，恢复了正常生活（见图1）。10月15日自然死亡，体长约15cm。共生存105d。

图1 三崎柱头虫自切再生虫体Fig.1 A regenerative body of B.misakiensis by self－cleavage

1981年10月6 日和16日采集的2批柱头虫，饲养期间各有1条个体沿着肝囊的前部自切为2个段片。再生情况与上述基本一致，前段能够重建虫体失去的后部所有器官，后段未能再生出失去的虫体前部。

1982年5～6 月间，又观察到2条自切为2段的个体，再生情况同上述基本一致。

2.2 横切手术后再生实验

1981年秋～1982年春对84条柱头虫做了A型、B型和C型分类手术横切实验，1982年4月对29条柱头虫做了C型手术横切重复实验（见表1）。

实验切割的断片70%能存活20d以上，46%能存活30d以上。各种不同手术类型的Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ段片都没有重建失去的器官和恢复完整的个体，没有再生能力。

不同手术类型的Ⅰ段片都能不同程度地重建失去的后部器官。能够重建全部失去的器官，实现再生的比率很高。手术横切再生的虫体见图2。

84条横切为2段、3段和4段的实验，Ⅰ段片的再生率分别为44%、59%和52%。29条C型手术横切为4个段片的重复实验，Ⅰ段片再生率为17%。包括重复实验在内的113条试验虫体Ⅰ段片的平均再生率为42%。生存30d以上的Ⅰ段片，65%实现了再生。3种不同切割类型的Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ断片均未发生再生。4例对照个体，在实验期间均发生了自切再生，情况如前所述。

3 讨论

本文结果表明，三崎柱头虫具有吻和领的自切前端机体几乎都能再生，重建失去的后部器官；具有吻和领的手术横切断片重建能力也很强，大约半数能再生缺失器官。生存时间越长的手术断片，实现再生的可能性越大，生存30d以上的断片65%可能再生。但是失去吻和领的自切和手术横切两者的其它断片均失去了这种再生能力。可见，含有吻和领的前端机体，对三崎柱头虫的器官重建、再生个体的重要性。

表1 三崎柱头虫横切断片成活与再生个体的统计Table 1 Regeneration of transverse parts in Balanoglossusmisakiensis

图2 三崎柱头虫手术横切再生虫体Fig.2 A regenerative body of B.misakiensis by operational cleavage

Tweedell[6]以玉钩虫科（Harrimanlidae）的科氏长吻虫（Saccoglossuskowalevlevskii）为材料，将虫体横切为2段观察它们的再生现象。结果随着断面自吻部逐步向后移动，后面片断再生身体前部器官的能力逐渐减弱。当断面在鳃区后部时，断片的再生极性发生了改变，即后段失去了再生前部器官的能力，而前段的后端却有较强的再生出身体后部器官的能力。他认为科氏长吻虫再生极性与切割面的部位有关。Miyamoto[8]将柱头虫（Balanoglossussimodensis）横切为10段，也发现虫体不同断片再生能力不同的现象。

Dawydoff[3]以实验的方法比较全面的研究了微小舌形虫（Glossobanlanussminutus）的再生现象。他将虫体从头部到尾部切为4段，Ⅰ段为吻和领部，Ⅱ段为鳃、生殖翼部，Ⅲ段为肝囊区和部分肠区，Ⅳ段为肠区和肛门。结果Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ段的前端均再生出吻、领和鳃等器官，第Ⅰ段没有再生出身体的后部器官。说明微小舌形虫除了含有吻和领的机体前端没有再生能力之外，机体其它部位的再生能力具有一致性，即有能力重建缺失的器官、再生出新的个体。

值得注意的是，三崎柱头虫的再生极性和微小舌形虫的再生极性表现出完全不同的分化。三崎柱头虫只有含有吻和领部的前部机体能够重建失去的器官实现再生，机体的其它部位没有这种能力。这种现象与已经研究过的其它肠鳃类动物[3，6，8]也是不相同的，值得进一步研究。

R9ttinger等[9]综述了半索动物的发育，认为这类动物处于动物发育的十字路口，并且可能成为研究再生现象的模式生物。

4 结论

（1）三崎柱头虫与其它肠鳃类相同，有较强的再生能力。

（2）三崎柱头虫自切或实验切割后，具有吻、领及鳃区的前段虫体具有再生后部器官恢复完整个体的能力。不具有这些器官的其它断片则没有再生能力。

（3）柱头虫与舌形虫相比较，再生能力在性质上具有明显的差异。

附言：国内柱头虫的研究工作始于1930年代。1960年代初进行了生殖生态研究，获得了早期胚胎，受到先师童第周先生的重视和支持。1960年代中期工作中断了。1980年代初期在饲养过程中发现了柱头虫的再生现象，开始对其再生进行研究。这次实验是国内至今仅有的一次柱头虫再生实验，先后经历了四代人的努力，历时三十余年。世界在这方面的研究也极少见。因为虫体柔软易断和营底内生活的习性，完整活体标本不易采集到是研究极少的重要原因之一。唐乐明、王统岗、刘海玲等帮助采得了大量的完整活体标本，钱培元、吴敏宁、管永红等学生参加了工作，仅致谢意！

[1]Spengel J W.Die Enteropneusten des Golfes von Neapel und der angrenzenden Meeres－Abschnitte[J].Fauna u Flora d Golfes von Neapel Monogr，1893，18：684.

[2]Kuwano H.On a new enteropneust from Misaki，Balanoglossus misakiensissp[J].Annot Zool Jap，1902，4：77－84.

[3]Dawydoff C.Beobachtungen uber Regenerations prozess bei den Enteropneusten[J].Zeitschr Wiss Zool，1909，93：237.

[4]Gilchrist J.Dimorphism and asexual reproduction inPtychodera capensis.J[J].Linnaean Soc，1923，35：393.

[5]Morton J E.The occurrence in New Zealand of the enteropneustBalanoglossusaustrallensis[J].Trans Roy Soc，1950，78：464－466.

[6]Tweedell K S.Regeneration of the enteropneustSacclglossus kawalevskii[J].Biol Bull，1961，120：118－127.

[7]Petersv J A N，Ditadi A S F.Asexual reproduction inGlossobalanuscrozieri（Ptychoderidae，Enteropneusta，Hemichordata）[J].Mar Biol，1971，9：78－85.

[8]Miyamoto N，Saito Y.Morphological characterization of the asexual reproduction in the acorn wormBalanoglossussimodensis[J].Dev Growth Differ，2010，52：615－727.

[9]Eric R9ttinger E，Christopher J，Lowe C J.Evolutionary crossroads in developmental biology：hemichordates[J].Development，2012，139：2463－2475.