一株鸡源致病性大肠杆菌噬菌体的分离及其生物学特性

王礼伟， 梁 晏， 屈勇刚， 杨亚东， 李 飞， 杨一鸣， 施研进

(1.石河子大学动物科技学院，新疆 石河子 832003;2.新疆生产建设兵团农八师石河子总场北泉镇兽医站，新疆 石河子832011

目前，在鸡业发展过程中，大肠杆菌病是一种较为常见高发病，常造成鸡局部或全身性感染［1-2］。大肠杆菌病是一种条件致病菌，差的卫生条件、不良的卫生管理，很容易造成大肠杆菌病的发生。随着养鸡业规模化、集约化的不断发展，大肠杆菌病越发严重，病原对抗生素和抗菌药的耐药性越来越强。为了防治鸡大肠杆菌病，饲养主大多采用饲喂抗生素或抗菌药物的方法，但普遍存在耐药性和用药成本升高等问题。同时，由于长期使用抗生素或抗菌药，使产品存在药物残留，导致产品品质下降，很难满足人们对绿色健康养殖的要求。

噬菌体是以细菌为寄主的一类非细胞微生物。自1917年人们发现噬菌体以来，利用噬菌体预防和治疗细菌性疾病引起了人们的关注［3］。早在20世纪初噬菌体治疗就已经取得过可喜的成果，国外第一次公开报道的噬菌体治疗是在1921年，利用噬菌体制剂治疗葡萄球菌皮肤感染［4］。现今，噬菌体的运用越来越广泛。利用噬菌体治疗具有一些先天性的优势:自身的繁殖能力强、裂解细菌的特异性较强、无耐药性、无残留等。本研究拟从养殖场污水及粪便中分离鸡大肠杆菌噬菌体，对其生物学特性进行分析。

1 材料与方法

1.1 菌株和污水

28株鸡源致病性大肠杆菌(Eco1～Eco28)由石河子大学动物科技学院传染病实验室分离鉴定，冻干保存于－20℃。污水采自石河子周边地区养鸡场附近，共10份。

1.2 主要试剂

LB培养基按文献［5］配制;普通营养琼脂、麦康凯培养基均购于北京奥博星生物技术有限责任公司。

1.3 宿主菌的准备

将28株鸡源致病性大肠杆菌分别接种到装有3 ml液体LB液体培养基的试管中，于37℃条件下，160 r/min振荡培养8 h，备用。

1.4 噬菌体的富集与分离

将采集的污水用8层纱布过滤，再用2层滤纸过滤，取过滤后的污水2.5 L，加入固体 CaCl2使终浓度达到1 mmol/L，在10 000 r/min下离心10 min。过滤除菌，取液体1 L，加入30 ml液体LB培养基和28株新鲜培养的鸡源致病性大肠杆菌悬液各1 ml，37℃振荡培养24 h，在10 000 r/min下离心5 min，上清液用0.22μm的滤膜过滤除菌。取28支试管，每管分别加入新鲜培养的28株鸡源致病性大肠杆菌悬液0.3 ml，再加入处理后的液体0.3 ml，振荡使其充分混匀，室温下静置10～15 min，使噬菌体和宿主菌充分吸附。再加5 ml已溶化的50℃左右0.7%半固体LB培养基，再次振荡混匀，然后均匀地铺在1.8%的固体LB琼脂上，待其凝固后，37℃倒置培养8～12 h，观察噬菌斑的生长情况［6］。

1.5 噬菌体的纯化

当有噬菌斑出现时，先取相应的宿主菌接种到5 ml液体LB培养基中，37℃、160 r/min振荡培养8 h。然后用10 μl枪头挑取单个噬菌斑接种到相应的宿主菌培养物中，37℃、160 r/min振荡培养 8 h，扩增噬菌体。然后在10 000 r/min下离心5 min，过滤除菌，无菌取上清液。单个噬菌斑经此方法反复纯化3～5次，即可得到较纯的噬菌体。

1.6 噬菌体的保存

将分离纯化后得到的噬菌体1 ml移入1.5 ml冻存管，每株噬菌体6管，置于－20℃冰箱中保存。

1.7 噬菌体生物学特性测定

1.7.1 噬菌体效价(滴度)测定 用LB液体培养基作为稀释液，把纯化后的噬菌体做连续10倍稀释，分别取100μl加入0.2 ml相应宿主菌，振荡使其充分混匀，室温静置15 min，使噬菌体充分吸附宿主菌。再加入5 ml已溶化的50℃左右的0.7%LB半固体培养基，再次振荡混匀，采用双层琼脂平板法，观察噬菌斑的生长情况［7］。上述每个稀释度分别做3个平行重复。计数时，选取噬菌斑数为30～300的稀释度平板，然后取适当稀释度3个平行重复的平均数，以计算噬菌体的滴度。噬菌体的效价(PFU/ml)=稀释倍数×平均噬菌斑数×100。

1.7.2 噬菌体裂解谱的测定 参照文献［8］，采用单斑法进行测定:即取28株鸡源致病性大肠杆菌的菌悬液分别均匀地涂在固体LB琼脂平板上，然后分别取2μl纯化后的噬菌体悬液，滴在平板不同的位置上，每板可滴4～6滴，悬液之间不能接触，37℃培养8～12 h，观察噬菌斑的生长情况。

1.7.3 噬菌体的最佳感染复数测定 感染复数(Multiplicity of infection，MOI)是指感染发生之前，噬菌体与宿主菌数量的比值。最佳感染复数为获得子代噬菌体最高产量时的MOI。据文献［9］，取分离株噬菌体对应的对数期菌悬液，按感染复数分别为 0.001、0.010、0.100、1.000加入噬菌体。37℃摇床振荡培养8 h，采用双层琼脂平板法测定最佳感染复数。

1.7.4 噬菌体的pH稳定性测定 用盐酸和氢氧化钠调节配制 pH 为4、5、6、7、8、9的 LB 液体培养基。取不同 pH 值的液体LB培养基1 ml分别加入试管，高压灭菌。将100μl噬菌体加入试管，在37℃条件下反应2 h。利用LB液体培养基进行稀释，取100μl噬菌体处理液，加入0.2 ml相应宿主菌，振荡使其充分混匀，室温静置15 min。采用双层琼脂平板法，测定不同pH值条件下噬菌体的效价。

1.7.5 噬菌体的温度稳定性测定 调节水浴锅的温度分别为30℃、40℃、50℃、60℃。将分离株噬菌体放在水浴锅静置1 h。利用LB液体培养基进行稀释，取100μl噬菌体处理液，加入0.2 ml相应宿主菌，振荡使其充分混匀，室温静置15 min。采用双层琼脂平板法，测定不同温度条件下噬菌体的效价。

1.7.6 噬菌体的紫外线稳定性测定 将1 ml噬菌体稀释液(1.98×102PFU/ml)加入平板中，直接暴露在超净工作台中，紫外线照射灯功率为20 W，距离为40 cm。在0 min、2 min、4 min、6 min、8 min、10 min、12 min 时，取 100 μl噬菌体处理液加入0.2 ml相应宿主菌，振荡使其充分混匀，室温静置15 min。采用双层琼脂平板法，测定不同照射时间条件下噬菌体的效价。

2 结果

2.1 大肠杆菌噬菌体的分离及噬菌斑的观察

采用双层琼脂平板法，肉眼可见大小不一、边缘整齐、无晕环、透明清晰的噬菌斑，在显微镜下测量其直径为0.597 mm。最终分离纯化出1株大肠杆菌噬菌体，将其命名为EcP10。

2.2 噬菌体EcP10效价(滴度)

通过双层琼脂平板法测定可知，噬菌体EcP10的效价为1.95 ×108PFU/ml。

2.3 噬菌体EcP10裂解谱

通过噬菌谱的测定，发现噬菌体EcP10可裂解28株鸡源致病性大肠杆菌(Eco1～Eco28)中的12株(Eco2、Eco4、Eco5、Eco6、Eco10、Eco13、Eco15、Eco16、Eco20、Eco23、Eco25、Eco26)，其裂解率为42.86%。

2.4 噬菌体EcP10的最佳感染复数

经过8 h的培养，通过效价的测定，当MOI=1时，噬菌体EcP10产生子代的效价为 5.8×108PFU/ml，为在4种不同条件下最高的，说明EcP10的最佳感染复数为1。

2.5 噬菌体EcP10的p H值稳定性

噬菌体EcP10经过6种不同的pH条件(pH 4、pH 5、pH 6、pH 7、pH 8、pH 9)处理2 h 后，在 pH 值为6 的时候，噬菌体的效价最高，为 6.25×106PFU/ml。当pH为4时，效价下降到3.3×105PFU/ml;当pH为9时，效价下降到1.15×105PFU/ml。这种趋势说明过酸、过碱都会造成噬菌体的裂解能力下降，明显影响噬菌体EcP10的活性。

2.6 噬菌体EcP10的温度稳定性

噬菌体EcP10经过4种不同温度(30℃、40℃、50℃、60℃)条件处理1 h后，温度为30℃时效价最高，达到6.75×105PFU/ml，同时，30 ～50 ℃ 时效价均维持在 105PFU/ml以上;60℃时，效价明显下降。这种趋势说明高温也严重影响噬菌体的活性。

2.7 噬菌体EcP10的紫外线稳定性

随着紫外线照射时间的持续，噬菌斑数目测定结果表明，噬菌体EcP10的活性逐渐降低。紫外线持续照射12 min时仅产生2个噬菌斑，紫外线的照射直接导致噬菌体快速失活。

2.8 噬菌体EcP10保存时间

分离株噬菌体EcP10在－20℃冰箱中保存1个月，噬菌体的效价为1.40×108PFU/ml，没有发生明显的变化。

3 讨论

噬菌体是感染细菌的病毒，可分为裂解性噬菌体和温和噬菌体。噬菌体对宿主细菌的裂解和感染是特异性的，是由受体决定的，很少产生耐药性的问题，也不会造成机体的菌群失调，每种细菌都有自身敏感的噬菌体。利用这一特性，用噬菌体杀灭细菌，称为噬菌体疗法［9］。作为一种微生态制剂，噬菌体治疗具有取材广泛、繁殖能力强、裂解细菌相对特异性、无耐药性、无残留等优点。因此，噬菌体相关研究越来越受到人们的重视［10］。近年来，噬菌体微生态制剂，已经广泛地应用于医学、兽医学、食品行业、养殖业、环境控制等相关领域［11］。

本试验利用鸡源致病性大肠杆菌作为宿主菌，从采自石河子周边地区鸡场附近的污水中分离纯化出1株鸡源致病性大肠杆菌噬菌体EcP10，同时对分离株噬菌体EcP10的生物学特性进行了系统分析。通过效价、噬菌谱、最佳感染复数、pH值稳定性、温度稳定性、紫外线稳定性的测定，以及在－20℃条件下保存1个月的效价变化等多项指标的测定，证实该分离株噬菌体EcP10具有较高的效价、较广的噬菌谱和较好的稳定性。本研究为后期研发噬菌体微生态制剂，开展噬菌体治疗工作奠定了基础。

［1］ 陈溥言.兽医传染病学［M］.5版，中国农业出版社，2006:111-112.

［2］ 程 汉，胡新岗，曹军平.鸡大肠杆菌病病原的分离鉴定及药敏试验［J］.江苏农业科学，2013，41(3):172-174.

［3］ ALISKY J，ICZKOWSKI K，RAPOPORT A.Bacteriophages show promise as antimicrobial agents［J］.J Infect，1998，36:5-15.

［4］ PAYNE R J，PHIL D，JANSEN V A.Phage therapy:the peculiar kinetics of self-replicating pharmaceuticals［J］.Clinical Pharmacology and Therapeutics，2000，68(3):225-230.

［5］ SAMBROOK J，RUSSELL D W.分子克隆实验指南［M］.黄培堂，译.3版.科学出版社，2002:27-30.

［6］ JAMALLUDEEN N，JOHNSON R P，FRIENDSHIPR，et al.Isolation and characterrization of nine bacteriophages that lyse O149 enterotoxigenic Escherization coli［J］.Vet Microbiol，2007，124:47-57.

［7］ 段书月，刘书梅，王国栋.肉鸡大肠杆菌的分离鉴定［J］.畜牧兽医杂志，2008，27(1):11-13.

［8］ 中国疾病预防控制中心结核病预防控制中心.全国第五次结核病流行病学抽样调查结果简介［J］.中国结核病预防控制，2011(3):14-16.

［9］ 孙荣华，李菁华，史红艳，等.大肠埃希菌噬菌体的分离鉴定及其生物学特性研究［J］.中国病原生物学杂志，2009，4(2):88-90.

［10］ LEDERBERGJ.Genetic recombination in Escherichia coli:disputation at cold spring harbor，1946-1996［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1996，93:3167-3168.

［11］ MCGRATH S，SINDEREND V.Bacteriophage:genetics and molecular biology［M］.Norfolk England:Caister Academic Press，2007:1221.