胃癌组织HER－2基因扩增和蛋白表达检测及临床意义

潘丹玲 陈小岩 林洁 李峰 陈新

胃癌组织HER－2基因扩增和蛋白表达检测及临床意义

潘丹玲 陈小岩 林洁 李峰 陈新

目的 探讨免疫组化（immunohistochemistry，IHC）法检测胃癌HER－2蛋白表达和荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）法检测HER－2基因扩增的临床意义。方法收集256例胃癌患者手术切除及胃镜活检的胃癌组织标本，分别采用IHC法及FISH法检测胃癌组织HER－2蛋白表达及基因扩增状态，并对结果进行统计学分析。结果256例胃癌组织标本中，有26例HER－2蛋白表达阳性，阳性率为10．16%；46例HER－2基因有扩增，阳性率17．97%。26例HER－2蛋白表达（3＋）的标本中，24例有HER－2基因扩增，2例无扩增；95例HER－2蛋白表达（2＋）的标本中，20例有基因扩增，75例无扩增；90例HER－2蛋白表达（1＋）的标本中，2例有基因扩增，88例无扩增；45例HER－2蛋白表达（0）的标本中，HER－2基因均无扩增。IHC法和FISH法检测HER－2表达阳性率差异无统计学意义（P＞0．05）。结论IHC法检测胃癌HER－2蛋白表达可作为临床治疗的初筛，HER－2蛋白表达（2＋）的患者应常规行FISH法，以确定HER－2基因扩增状态。FISH法检测结果具有较高的稳定性和可靠性，联合IHC法可更准确和客观评价胃癌预后，并指导临床选用靶向药物治疗。

胃癌；HER－2基因；免疫组织化学；荧光原位杂交

胃癌是消化系统恶性肿瘤，是世界第二致死癌症，中国为高发区。该病预后差，早期诊断较困难，绝大多数患者直到晚期才出现相应症状。进展期胃癌患者约20%表现人表皮生长因子受体2（human epidermalgrowth factor receptor2，HER－2）蛋白过表达或基因扩增，HER－2蛋白过表达能预测多种化疗药物及内分泌治疗的敏感性，并指导靶向治疗药物（曲妥珠单抗）的选择。一项包括中国在内的24个国家参与的全球多中心随机对照III期临床研究（ToGA试验）［1］的结果显示，化疗联合曲妥珠单抗可显著延长进展期胃癌患者的生存期。所以，正确检测和评定HER－2蛋白表达和基因扩增对胃癌临床治疗和预后判断有重要价值。2010年欧洲药品管理局及美国食品药品监督管理局先后批准化疗联合使用曲妥珠单抗治疗HER－2阳性胃癌患者。参照2009年《乳腺癌HER－2检测指南》，我国于2011年发布《胃癌HER－2检测指南》［2］，本文研究按照该指南，应用免疫组化（immunohistochemistry，IHC）法检测胃癌HER－2蛋白表达和荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）法检测HER－2基因扩增水平，为正确评估胃癌患者预后及临床选择治疗方案提供可靠依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料选择我院2012年1月至2013年6月手术切除及胃镜活检的胃癌标本256例，术前或活检前均未接受放、化疗及免疫治疗，均经病理学明确诊断为胃癌。其中男性120例，女性136例，平均年龄（40．5±10．0）岁。肿物直径最小0．5 cm，最大13．5 cm。具体临床病理资料见表1。

表1 256例胃癌患者的临床病理参数

1.2 方法送检组织在离体后20－30min内进行标记、切开，采用新鲜配制的4%中性缓冲甲醛液固定，固定时间为8－24 h；石蜡包埋、切片脱蜡、HE染色，IHC采用Elivision二步法，以已知HER－2 IHC（3＋）的胃癌组织作为阳性对照，以PBS代替一抗作空白对照。HER－2抗体克隆号为SP3，为福州迈新生物技术开发有限公司产品。Path Vysion HER－2 DNA探针试剂盒购自美国Vysis公司。

1.2.1 IHC法检测HER－2蛋白表达根据《胃癌HER－2检测指南》［2］评判标准，对于手术标本，光镜下观察结果，≥10%肿瘤细胞基底侧膜、侧膜或完全性膜强染色，判为HER－2（3＋）；≥10%的肿瘤细胞有弱至中度的基底侧膜、侧膜或完全性膜染色，判为HER－2（2＋）；≥10%肿瘤细胞微弱或隐约可见膜着色，仅有部分细胞膜染色，判为HER－2（1＋）；无反应或＜10%肿瘤细胞膜染色，判为HER－2（0）。对于活检标本，光镜下观察结果，肿瘤细胞的基底侧膜、侧膜或完全性膜强染色（不管着色的肿瘤细胞占整个组织的百分比，但至少有5个成簇的肿瘤细胞着色），判为HER－2（3＋）；肿瘤细胞团有弱到中度的基底侧膜、侧膜或完全性膜强染色（不管着色的肿瘤细胞占整个组织的百分比，但至少有5个成簇的肿瘤细胞着色），判为HER－2（2＋）；肿瘤细胞团微弱或隐约可见膜染色（不管着色的肿瘤细胞占整个组织的百分比），判为HER－2（1＋）；任何肿瘤细胞无膜染色，判为HER－2（0）。HER－2蛋白表达（3＋）判定为阳性表达（过表达），其余均为阴性表达。

1.2.2 FISH法检测HER－2基因扩增水平胃癌HER－2原位杂交判读方法参照ToGA研究经验［3］，荧光显微镜下观察结果，选择扩增程度最高的区域，计数至少20个肿瘤细胞核中的双色信号，统计Ratio值（Ratio＝20个细胞核中红色信号总数／20个细胞核中绿色信号总数，即HER－2与CEP17的比值）。Ratio≥2．2为阳性，提示HER－2基因扩增；Ratio＜1．8为阴性，提示HER－2基因无扩增；Ratio在1．8～2．2为不确定，需要再计算20个细胞核中的信号或由另一位医师重新计数，若Ratio≥2．0判为阳性，Ratio＜2．0判为阴性。

1.3 统计学处理采用SPSS19．0统计软件对数据进行统计学分析，计数资料以百分数表示，组间比较采用χ2检验。以P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 IHC法检测HER－2蛋白表达结果256例胃癌患者的组织标本中，有26例HER－2蛋白表达为（3＋），阳性率为10．16%，95例HER－2蛋白表达为（2＋），阳性率为37．11%，90例HER－2蛋白表达为（1＋），阳性率为35．16%，45例无HER－2蛋白表达。HER－2蛋白表达结果见图1～图4。

图1 胃癌HER－2蛋白表达为（3＋）

图2 胃癌HER－2蛋白表达为（2＋）

图3 胃癌HER－2蛋白表达为（1＋）

图4 胃癌HER－2蛋白表达为（0）

2.2 FISH法检测HER－2基因扩增结果256例胃癌患者的组织标本中，46例有扩增，210例无扩增，扩增率为17．97%。HER－2基因的扩增结果见图5 、图6 。

图5 FISH法检测胃癌组织HER－2基因有扩增

图6 FISH法检测胃癌组织HER－2基因无扩增

2.3 两种检测方法的比较在26例HER－2蛋白表达（3＋）的胃癌组织标本中，有24例出现HER－2基因扩增，2例无扩增；95例HER－2蛋白表达（2＋）的胃癌组织标本中，20例有基因扩增，75例无扩增；90例HER－2蛋白表达（1＋）的胃癌组织标本中，2例有基因扩增，88例无基因扩增；45例HER－2蛋白表达为（0）的胃癌组织标本中，均无基因扩增。IHC法检测HER－2蛋白表达阳性率（10．16%）和FISH法检测HER－2基因扩增阳性率（17．97%）比较，差异无统计学意义（χ2＝0．782，P＞0．05），见表2。

表2 胃癌患者HER－2基因扩增及蛋白表达结果［n（%）］

3 讨论

HER－2是原癌基因，定位于染色体17q21，是相对分子质量为185×103的跨膜糖蛋白，简称为HER－2蛋白或受体。HER－2是一种跨膜酪氨酸激酶受体，通过与相应配体结合，调节细胞生长、生存、分化和凋亡。研究［4］表明，HER－2过表达的恶性肿瘤具有更强的侵袭、转移能力，患者预后较差。准确检测HER－2状态十分必要，可预测胃癌预后，并指导分子靶向药物曲妥珠单抗的治疗。曲妥珠单抗可特异性地识别癌细胞HER－2胞外域的抗原决定簇，抑制HER－2对肿瘤细胞向恶性表型的转导［3］。临床上，曲妥珠单抗对HER－2阳性胃癌患者具有一定的治疗效果，不但降低胃癌复发转移率，而且能肯定改善HER－2基因过表达患者的生存，使得胃癌患者在常规治疗进行的基础上进一步获益。

准确检测胃癌HER－2表达和基因扩增情况是进展期胃癌HER－2靶向治疗患者筛选和治疗疗效预测的前提。目前，常用的HER－2蛋白与基因的检测方法为IHC法和FISH法。HER－2蛋白检测要求实验室必须有规范化流程和质量控制体系，只有严格遵循标准化流程的实验过程才能提供可信赖的实验结果［5］。

在我国各大医院病理科实验室，IHC法仍是HER－2蛋白检测的主要手段。IHC法具有成本低廉、方法简单、生物学关联密切、可重复性好等优点，而且IHC切片可同时观察组织学形态，其切片可长期保存且反复评估。但是IHC法染色存在定量性不强、抗体差异、抗原修复方法不同及组织固定和制片等因素的影响，以及结果的主观判读等，使检测结果受影响，导致不同医院病理实验室之间结果有较大的差异性。IHC法的这些缺陷将会影响检测结果对临床治疗的指导。

FISH法是一种分子细胞遗传学技术，在组织切片上显示细胞内特异性DNA片段。通过荧光标记的DNA探针与细胞核内的DNA靶序列杂交，在荧光显微镜下，分析细胞核内杂交的DNA靶序列的多种彩色探针信号，以获得细胞内多条染色体（或染色体片段）或多种基因状态的信息。应用该技术检测HER－2基因具有较高的稳定性和重复性，因此测定结果具有高度的准确性、灵敏度和特异性，其结果在不同实验室间一致性很高。但FISH法检测费用较高，信号强度随时间衰减，不能同时观察细胞形态且较难鉴定胃癌微小浸润灶。胃癌HER－2检测异质性较常见，在胃癌中，有5%～30%的病例出现肿瘤异质性。Rüschoff等［6］研究者认为，因为胃癌的异质性，IHC法的预测价值比FISH法高。在IHC法的染色切片上，胃癌异质性区域可结合全片分析，而FISH法在暗视野100倍物镜下观察，难以在同等时间内全面把握切片信息，因此FISH法不能作为首次或唯一决定是否适合靶向治疗的检测，而IHC法可用于胃癌患者HER－2靶向治疗的初步筛选。

HER－2状态的准确检测和判读需要标准化方法的支持，也需要结合足够的临床资料来判断，使患者得到更有效的治疗，真正成为个体化治疗的受益者。本文研究对256例胃癌患者采用IHC法和FISH法检测HER－2状态，结果表明，IHC法和FISH法检测HER－2结果差异无统计学意义。目前，国内外不同研究［7－9］报道的HER－2蛋白过表达率为6．8%～34．0%。本文研究中，IHC法检测蛋白表达（3＋）为26例，阳性率为10．16%，与以上报道一致。本文研究结果显示，IHC法检测HER－2无表达时，FISH法检测HER－2均无基因扩增。IHC法检测为（2＋）时，FISH法检测阳性率为21．05%，故IHC法检测为（2＋）的患者需要进一步行FISH法检测来确定是否存在基因扩增。IHC法检测（3＋）患者中，FISH法检测有2例为阴性，17号染色体多体可能是导致IHC法检测强阳性而FISH法检测为阴性的主要原因，胃癌17号染色体多体可引起HER－2蛋白表达的增强，因此，必要时这类患者应进一步行FISH法检测。90例IHC法检测结果为（1＋）的患者中，有2例（2．22%）出现HER－2基因扩增，认为17号染色体单体可能是IHC法检测（1＋）而FISH法检测有基因扩增的原因。还有胃活检小标本，因不能代表肿瘤的整体，故进一步的HER－2基因扩增检测对IHC法检测（0）或（1＋）的病例仍有一定意义。

综上所述，IHC法可以用作临床靶向药物治疗的初筛，对于IHC法检测（0）或（1＋）及（3＋）的患者可选择性行FISH法检测，而对于IHC法检测（2＋）的患者应行FISH法检测，以确定HER－2基因状态来指导临床的诊疗，临床工作中对这部分患者进行FISH检测的意义最大［10］。HER－2基因检测的准确性是患者得到正确治疗的基础。IHC法和FISH法联合检测，可准确评估HER－2状态，并准确和客观评价胃癌患者预后，指导临床选用靶向药物治疗。

1 BangYJ，VanCutsemE，FeyereislovaA，etal．Trastuzumab in combination with chemotherapy versus chemotherapy alone for treatmentof HER2 －postive advanced gastric or gastro －oesophageal junction cancer（ToGA）：aphase3，open－label，randomisedcontrolledtrial．Lancet，2010，376：687－697．

2 《胃癌HER－2检测指南》编写组．胃癌HER－2检测指南．中华病理学杂志，2011，40：553－557．

3 ShakS．Overview of the trastuzumab（Herceptin）anti－HER2 monoclonal antibody clinical program in HER－2 overexpression metastatic breast cancer． Herceptin Multinational Investigator Study Group． Semi Oncol，1999，26：71－77．

4 Meert AP，MartinB，PaesmansM，etal．TheroleofHER－2／neu expressionon the survival of patients with lung cancer：asystematic reviewof the literature．BrJCancer，2003，89：959－965．

5 Arena V，PennacchiaI，MonegoG，etal．Fluorescent in situ hybridization as a primary test for HER－2 status in breast cancer：controversies．JClinOncol，2010，28：e83－e84．

6 Rüschoff J，DietelM，BarettonG，etal．HER2 diagnostics in gastriccancer－guideline validation and development of standardized immunohistochemical testing.VirchowsArch，2010，457：299－307．

7 Hofmann M，StossO，ShiD，etal．Assessment of a HER2 scoring system for gastric cancer：results from a validation study． Histopathology，2008，52：797－805．

8 武鸿美，刘艳辉，林锋，等．中国胃癌患者HER2蛋白表达与临床病理学参数及预后的关系．中华病理学杂志，2011，40：296－299．

9 Rüschoff J，HannaW，BilousM，etal．HER－2 testing in gastric cancer：a practical approach．Mod Pathol，2012，25：637－650．

The clinical significance of detecting HER－2 protein expression and HER－2 gene amplification in gastric carcinoma

PAN Dan－ling,CHENXiao－yan,LIN Jie，etal,Departmentof Pathology,Fujian Provincial Hospital,Provincial Clinical Medical College of Fujian MedicalUniversity，Fuzhou 350001，China

ObjectiveTo detect the expression of HER－2 protein by immunohistochemistry（IHC）method and HER－2 geneamplification by fluorescence in situ hybridization（FISH）method in gastric cancer，and to evaluate the clinical significance．Methods256 casesgastric cancer tissue samp les by surgical excision and gastroscopic biopsieswere collected．HER－2 gene amplification and HER－2 protein expression were examined by FISHmethod and IHCmethod respectively．All data were analyzed statistically．ResultsIn 256 samples from gastric carcinoma patients，there were 26 cases had HER－2 protein positive experssion，and 46 cases had HER－2 gene amplification．The positive rates were 10.16％ and 17.97％ respectively.There were 24 cases showed positive HER－2 gene amplification in 26 patients with HER－2 protein expression（3+），20 cases showed positive HER－2 gene amplification in 95 patients with HER－2 protein expression（2+），and 2 caseshowed positive HER－2 gene amplification in 90 patients with HER－2 protein expression（1+），There was nopositive HER－2 gene amplification in 45 patients with HER－2 protein expression（０）．The difference of these two methods in HER－2 protein expressive detection had no statistical significance（P＞0.05）．ConclusionThe IHC method detection of gastric cancer HER－2 protein expression can be used as a initial clinical screening．In cases of HER－2 protein expression（2+），HER－HER－2 gene amplification shall be detected by FISH method．FISH method has a higher stability and reliability than IHC method．The combination of FISH and IHC methods used to detect the expression of HER－2 in gastric carcinoma is the best way which guide the selection of targeted drug therapy and the evaluation of prognosis．

Gastric carcinoma；HER－2；Immunohistochemistry；Fluorescence in situ hybridization

10．3969／j．issn．1674－7151．2014．01．003

2013－11－29）

（本文编辑：杨军）

350001 福州市，福建医科大学省立临床医学院福建省立医院病理科