药物代谢检测技术的研究进展

关 皎,朱鹤云

(吉林医药学院，吉林 吉林 132013)

·综 述·

药物代谢检测技术的研究进展

Research progress on detection methods of drug metabolism

关 皎,朱鹤云*

(吉林医药学院，吉林 吉林 132013)

药物代谢在新药研发的各个阶段都起着至关重要的作用，并且日益受到制药行业的重视。本文以国内外大量有代表性的文献为依据进行分析、整理和归纳，介绍药物代谢检测技术的国内外研究进展。

药物代谢；检测技术；进展

药物代谢也称生物转，是指药物被机体吸收后，在体内各种酶以及体液环境作用下发生的一系列化学反应，导致药物化学结构上的转变。近年来，我国的新药创制快速发展，目前每年约有30余种新化学结构药物被批准进行临床试验。美国作为制药工业强国，每年进入临床试验的新药多达1 000种以上。在新药研发的各个阶段，药物代谢研究都起着重要的作用。在药物发现中，进行代谢研究的目的是选择吸收、分布、代谢和排泄性质优越的化合物，并剔除具有潜在风险的化合物；在药物开发中，进行代谢研究的目的是选定化合物在动物和人体内处置的详细数据。因此，自20世纪80年代起，药物代谢研究受到制药行业的高度重视，并越来越早地介入到药物设计、筛选和评价中，成为新药设计和开发各个阶段的关键组成部分，使新药开发阶段由于药动学原因导致的失败率从近40%降至10%左右，提高了新药研发的成功率，并降低了成本[1]。在探讨药物代谢特征、确定药物代谢物结构及代谢途径、药物及代谢物的药理作用及毒副作用等药物代谢研究方面，灵敏、准确的检测技术是必不可少的。本文以国内外大量有代表性的文献为依据进行分析、整理和归纳，综述了药物代谢检测技术的国内外研究进展。

1 气相色谱-质谱联用技术

商品化气相色谱-质谱(GC-MS)联用仪出现于20世纪70年代，此后随着衍生化GC方法及MS技术的发展，其在药物代谢产物研究领域得到广泛应用。但GC法对样品的极性和热稳定性有一定的要求，而代谢物一般均具有极性基团，熔点高、挥发性差，因此需要先进行衍生化，再用GC-MS分析。此外，对于Ⅱ相代谢产物，由于其与葡萄糖醛酸、硫酸、谷胱甘肽、半胱氨酸等结合后不易完全衍生化或制成衍生物后结构太大仍不易气化，故其一般需先经水解，然后进行衍生化，再用GC-MS分析[2]。

黄克建等[3]利用固相萃取/气质联用(SPE/GC-MS)法对服用硝基安定的大鼠的尿液进行研究，检出7-氨基硝基安定、7-乙酰氨基硝基安定以及硝基安定的杂环开环代谢物2-氨基-5硝基苯基苯甲酮；确定硝基安定在大鼠体内至少存在2种代谢途径：一是硝基安定7位硝基被还原为氨基，氨基再被乙酰化，二是硝基安定的杂环开环生成2-氨基-5硝基苯基苯甲酮。该课题组还采用GC-MS研究氯硝安定的代谢情况[4]，结果在大鼠尿液和志愿者尿液中均检出7-乙酰氨基氯硝安定和7-氨基氯硝基安定；在大鼠血液中，主要检出氯硝安定和7-氨基氯硝基安定；在大鼠肝组织中，主要检出7-乙酰氨基氯硝安定，还有少量7-氨基氯硝安定和氯硝安定。张思敏等[5]通过对Wistar大鼠进行灌胃服用氯丙嗪后收集24 h内尿样，经固相萃取净化提取后，采用GC-MS(EI、PCI)检测，对比空白尿液与阳性尿液萃取液的质谱图，并根据质谱裂解规律鉴定其结构，结果共检测出16种代谢产物，其中2-氯吩噻嗪、丙嗪、去甲基氯丙嗪、7-羟基氯丙嗪和氯丙嗪亚砜为主要代谢产物。

2 液相色谱-质谱联用技术

虽然GC-MS是一种比较成熟的技术，在我国已有30多年的应用历史，但在医药研究领域中，由于大量药物是极性较大的化合物，仅有约20%的药物可用GC分析，其中多数还必须经过衍生化步骤，因此局限性很大。为了弥补GC-MS难以分析强极性和难挥发性样品这一不足，人们一直致力于其他色谱-质谱联用技术的研究，其中最重要的就是液相色谱-质谱(LC-MS)联用技术。该技术以色谱进行分离，以MS为检测手段，它集LC的高分离能力与MS的高灵敏度、强定性、专属性于一体，可获得复杂混合物中单一成分的质谱图。特别是近年来应用愈加广泛的液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)联用技术，其具有比MS/MS和LC-MS更优越的性能。LC-MS/MS可在一级质谱MS条件下获得很强的待测组分的准分子离子峰，几乎不产生碎片离子，并可对准分子离子进行多级裂解，进而获得丰富的化合物碎片信息，可用来推断化合物结构、确认目标化合物、辨认重叠色谱峰以及在高背景或干扰物存在的情况下对目标化合物定量。因此LC-MS和LC-MS/MS技术已成为药物代谢产物结构鉴定以及药物代谢产物痕量分析中强有力的工具[6]。

在药物代谢产物结构鉴定方面，Zhang Xia等[7]以人肝微粒体、人源HepG2细胞核人重组酶作为药物代谢模型，研究狼毒乙素和新狼毒素A的代谢特性，推断了狼毒乙素和新狼毒素A在人体的可能代谢途径及代谢酶。王瑞等[8]应用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱联用技术(UPLC-QTOF-MS/MS)并辅以代谢数据采集和处理软件，快速筛查了两类新型非核苷类逆转录酶抑制剂先导物DAPA-7012 和DAAN-4442 在大鼠肝微粒体的代谢产物，并分析结构中的代谢软点。

在药物代谢产物痕量分析方面，周宛虹等[9]以氘代尼古丁、氘代可的宁、3-OH-氘代可的宁、氘代尼古丁葡萄糖醛酸复合物、氘代可的宁葡萄糖醛酸复合物、3-OH-氘代可的宁葡萄糖醛酸复合物作内标，在LC-MS/MS的大气压化学电离(APCI)离子化模式下,建立了快速检测吸烟者尿液中尼古丁及其9种代谢物的方法，并对19个实际样品进行了测试和判别分析。金经等[10]采用柱前衍生化LC-MS/MS法同时测定人血浆中厄多司坦及其含巯基活性代谢物，并将该方法应用于厄多司坦片人体药动学研究，为合理制订给药方案提供了药动学依据。

3 核磁共振及其联用技术

虽然LC-MS和LC-MS/MS在药物代谢的研究中已经有广泛的应用，但LC-MS却不能明确地鉴定具有光学和几何异构体以及同分异构体的化合物结构，一些不易离子化的极性化合物MS响应很低，生物基质也可能抑制化合物的离子化[11]，这些因素增加结构鉴定的难度。因此，在某些研究中需要利用核磁共振(NMR)来研究化合物的结构信息。特别是近年来随着核磁共振仪在灵敏度、分辨率、动态范围等方面技术的提高，以及计算机技术在NMR测定中的应用，NMR技术已经成为测定分子结构的最有效工具，利用NMR技术对代谢组分进行检测，研究这些组分的NMR图谱，可得到相应的代谢物信息，综合分析这些信息所反映的生物学意义，可以了解生物体代谢的规律。但如果单用NMR分析生物样品时,氢谱中会出现大量的包括内源性杂质在内的信息，很难分辨出哪些是代谢物的信号。所以有必要将色谱分离技术与NMR技术以及其他技术进行在线的联用，使色谱分离与光谱鉴定成为一个连续的过程，成为代谢物结构鉴定的针对性工具。目前，正处于快速发展阶段的NMR联用技术主要包括固相萃取-核磁共振联用(SPE-NMR)、液相色谱-核磁共振联用(LC-NMR)、液相色谱-核磁共振-质谱联用(LC-NMR-MS)、毛细管电泳-核磁共振联用(CE-NMR)、毛细管电色谱-核磁共振联用(CEC-NMR)、毛细管电泳-核磁共振-质谱联用(CE-NMR-MS)、液相色谱-红外光谱-核磁共振-质谱联用(LC-FT/IR-NMR-MS)、超临界色谱-核磁共振联用(SFC-NMR)等[12]。

3.1 固相萃取-核磁共振联用

固相萃取(SPE)的原理是利用样品在固定相和流动相之间的分配系数不同以达到分离不同组分的目的。由于生物样品中存在大量内源性物质，往往对药物及其代谢产物产生干扰，使得核磁共振仪难以直接检测出生物样品，用SPE技术可以方便的分离掉生物样品中的内源性物质。SPE的一个突出特点是可以富集样品，这种方法花费便宜，不要求HPLC等色谱法中优化分离的条件，并且由于大部分内源性物质可被除去，使图谱的解析变得容易。实验中200 MHz和300 MHz NMR就可以用来进行检测，因此20世纪80年代以来很多药物代谢的研究都采用这种方法。

杨春等[12]利用SPE-NMR技术在未将代谢产物完全分离的情况下，通过代谢物与原药不同特点的特征峰，推断出代谢产物的结构或代谢片段。从大鼠尿液中检测出乙哌立松ω-1位羟基化、羰基还原成羟基、氮脱烷基并氧化脱羧和氮脱烷基及再脱水等3个主要代谢产物和一个代谢片段，其中氮脱烷基并氧化脱羧形成烷烃片段和末端羟基化代谢产物为新发现的代谢产物。

3.2 液相色谱-核磁共振联用

LC-NMR联用技术是由液相色谱提供分离技术，核磁共振仪提供结构解析技术，从复杂的药物代谢产物获得单一组分的图谱进行结构推测。解决了固相萃取对于结构复杂的药物代谢产物的鉴定困难的问题。随着核磁共振仪磁场强度的增强，灵敏度有了很大的提高，溶剂峰抑制技术的不断完善，促进了LC-NMR 联用技术在药物代谢研究中的发展。并且与常规的代谢物分离鉴定方法相比，LC-NMR法省时,尤其适用于不稳定化合物，无需复杂的预处理，可避免使用放射性标记物质。

Cloarec等[13]使用LC-Cryprobes(低温探头)-NMR联用进行生物样品中代谢物和代谢组学研究。Vita等[14]采用LC-UV-NMR进行大鼠注射嘌呤类药物Roscovitine后组织中的3个代谢物结构鉴定、分布，并对代谢物进行动态研究。

3.3 液相色谱-核磁共振-质谱联用

当使用LC-NMR确定未知物结构时,常需要用其他方法进一步证实。目前最新的技术是将LC、NMR和MS三种仪器在线联合使用，形成LC-NMR-MS在线系统，它是进行药物代谢产物结构等方面的研究的有力工具。这种联用技术实际上是两种检测手段(NMR和MS)的相互补充，具有以下优点[15]：(1)它同时能得到化合物的UV、NMR和MS信息,为解析复杂的药物代谢产物的结构提供了全面的信息；(2)硫酸盐等结合而生成的代谢产物只有通过NMR和MS信息才能共同确定它的结构；(3)许多通过其他方法无法测定的内源性代谢物也能用此联用技术检测出来。

Godejohann等[16]利用LC-SPE-NMR-MS和低温探头技术研究了人尿中对乙酰氨基酚的代谢物，并鉴定了一种微量的新代谢产物ether glucuronide of 3-methoxy-paracetamol。Kammerer等[17]利用LC-Qq-TOF-MS和600 MHz LC-SPE-cryprobes-NMR-MS研究了小鼠肝微粒体中选择性p38MAP激酶抑制剂ML3403的代谢物的结构，共鉴定出了8个代谢物，并研究了它们在小鼠体内的代谢过程。

4 毛细管电泳技术

毛细管电泳(CE)技术是近年来发展较快的一种检测方法，它是一类以毛细管为分离通道，以高压直流电场为驱动力的新型液相分离分析技术。与传统的分离分析方法相比，CE由于其分离效率高、分析速度快、样品消耗少及操作成本低等优点而被广泛应用在生物化学、临床医学、环境科学等多种领域[18]。

王秀中等[19-20]采用两步固相萃取法结合无胶筛分毛细管电泳技术测定单次和多次给药后猕猴血浆中的反义寡核苷酸药物癌泰得及其代谢产物M1和M2的血药浓度，揭示癌泰得及其代谢产物在猕猴体内的代谢清除过程，为将来的临床试验提供参考。李旭菲等[21]建立了同时检测家犬尿样中氯丙嗪、异丙嗪及其主要代谢物氯丙嗪亚砜、异丙嗪亚砜的毛细管电泳电致化学发光的方法，该方法简便、快速、灵敏、进样量少，不受共存物干扰，可在不必预分离的情况下直接同时连续测定。

5 展 望

对药物代谢产物的检测、结构鉴定和定量已经成为新药研发过程中一个重要组成部分，随着人们对药物代谢的深入研究，如代谢机制的推测以及痕量代谢产物的测定等，对检测技术的要求也越来越高。各种检测技术的不断发展以及各种联用技术的产生，使药物代谢检测技术朝着更快、更灵敏、更准确的方向发展，这种发展将会使药物代谢与结构鉴定方面取得更大的突破，进而大大加速新型药物的研究与开发。

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1673-2995(2014)01-0058-04

关 皎(1983-)，女(汉族)，讲师，在读博士.

朱鹤云(1982-)，男(汉族)，讲师，在读博士.

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2013-09-06)