蚊虫嗅觉受体的研究进展*

代玉华 赵忠懿 程 鹏 刘丽娟 公茂庆**

(1.山东省医学科学院，山东省寄生虫病防治研究所，山东济宁 272033；2.河南出入境检验检疫局；郑州 450003)

蚊虫传播的疟疾、登革热、黄热病和日本脑炎等疾病每年威胁着几亿人的健康，并导致上百万人的死亡。蚊媒传染病防控的重要手段是控制蚊虫种群数量和密度。防治媒介蚊虫的传统方法主要是采用化学杀虫剂进行灭杀，但化学杀虫剂的大量使用，不仅造成环境的污染，还导致蚊虫抗药性的不断扩散和增强。如何利用蚊虫的生理特征探索更环保、有效的防治途径是如今研究的热点。

嗅觉系统影响着蚊虫对栖息地的选择、繁殖、觅食、吸血、趋避及信息传递等行为。嗅觉感应器是蚊虫感知周围环境中化学气味小分子的单位，分布于蚊虫的嗅觉系统——触角与下颚须(Syedetal.,2007)。嗅觉感受器形态各异且数量很多，它们的表皮上有许多细小的孔洞，化学气味小分子就利用这些孔洞进入。嗅觉感受器中分布着嗅觉神经树突，在神经树突表面存在许多嗅觉受体蛋白(Olfactory receptors,ORs)，这些受体蛋白感知到化学气味小分子后将信息传递到昆虫大脑。大脑综合了各种信息后发出指令，从而影响到蚊虫的行为。近年来随着生物信息学及分子生物技术的发展,蚊虫中参与嗅觉信号转导过程中的一些重要蛋白被克隆和鉴定。主要包括目前发现的嗅觉受体蛋白、气味结合蛋白(Ordorant binding proteins,OBPs)和气味降解酶(Odor degrading enzymes,ODEs)等。嗅觉受体作为嗅觉系统的关键成分之一，其研究是认识蚊虫化学信号分子识别机制的重要环节，对于开发更有效的行为调控技术进行蚊虫防治也具有重要价值。

1 蚊虫嗅觉受体蛋白的特征

1991年由Buck 和Axel在哺乳动物鼠类中首次发现OR蛋白，而昆虫的OR蛋白是1999年由3个实验室同时在果蝇Drosophilamelanogaster中发现 (Clyneetal.,1999; Gaoetal.,1999; Vosshalletal.,1999)。随着许多生物物种的基因组被测定，目前已经获得1个OR大家族。在蚊虫中，冈比亚按蚊Anophelesgambiae、埃及伊蚊Aedesaegypti、致倦库蚊Culexpipiensquinquefasciatus分别有79、131、180个OR(Hilletal.,2002; Bohbotetal.,2007; Arensburgeretal.,2010)已经被识别。Scialo等(2012)鉴定出首个白纹伊蚊Ae.albopictus的OR(AalOR2)。

蚊虫的OR是一类 G蛋白偶联蛋白(G-protein coupled receptor,GPCR)，通常具有7个跨膜区域，并分布于嗅器中的树突表面(Hallemetal.,2006a)，整个蛋白的氨基酸残基为400～600 个且与脊椎动物及线虫OR的同源性极低。但也有研究报道，由于昆虫OR蛋白的N末端在胞内，而C末端在胞外，所呈现的膜拓扑学结构与哺乳动物OR截然相反，从严格意义上讲，昆虫的OR不应属于G偶联蛋白(Bentonetal.,2006b)。在冈比亚按蚊中进行的OR结构分析进一步证实昆虫的OR不同于典型的G蛋白偶联受体(Tsitouraetal.,2010)。昆虫气味受体的类型可以分为7次跨膜受体、昆虫味觉受体、谷氨酸受体和离子型受体(Kauppetal.,2010)。

2 嗅觉受体的表达与功能

昆虫的一个嗅觉神经元可以表达1～3个OR蛋白(Vosshalletal.,1999)，而哺乳动物的一个神经元只表达一种受体蛋白(Mombaerts,2004)。尽管多数生物都表达数百种OR 蛋白,但气味分子的数目远远多于OR 的数目。每种OR可以感受多种气味分子，多种OR还可以感受同一种气味分子，由此不同的OR 组合就可以检测不同的气味分子(Malnicetal.,1999)。数量有限的OR可以通过变化不同组合来检测所有气味分子。这样组成了感受化学信息的编码谱(Dobritsaetal.,2003; Hallemetal.,2006a,2006b; Vosshalletal.,2007)。

有些OR 基因可以进行共表达。在对冈比亚按蚊CO2受体的研究中发现，可感受CO2的受体基因Gr21a和Gr63a，GPRGR22 和GPRGR24 表现出共表达(Jonesetal.,2007)。还有研究发现OR 基因的表达有一定的性别依赖性。采用RT-PCR 和qRT-PCR 技术来比较雄性按蚊和雌性按蚊OR mRNA 的表达水平，结果显示宿主气味物质更容易激活雌性个体OR 的表达(Iatrouetal.,2008)。另外，OR 基因的表达与昆虫宿主之间还存在协同进化的现象，宿主的种类和数量会影响OR基因的表达(Mcbrideetal.,2007)。

第一个获得功能鉴定的昆虫OR是果蝇Or43a。Wetzel 等(2001)在非洲蟾蜍卵母细胞中注射Or43a cRNA 和G 蛋白的Gα15 亚基， 双电极电压钳的结果显示，较低浓度的环己酮、环己醇、苯甲醛和苯甲醇等气味分子即可激活Or43a 受体，而1，3-环己二酮、1，4-环己二酮、甲苯、3-苯甲醛、苯乙醛和正己醇等类似物却不能激活它们。

OR2是蚊虫中进行功能研究较多的OR蛋白。Carey等(2010)利用膜片钳技术，在爪蟾卵细胞中表达冈比亚按蚊的OR复合物，研究结果表明，同果蝇一样，冈比亚按蚊的OR复合物也分为两种类型，识别谱较窄的受体(Specialist)和广谱识别受体(Generalist)。每一种冈比亚按蚊的OR都有特定的气味反应特征和识别范围，并且，有些气味可以激活某些嗅觉神经元而抑制其他嗅觉神经元。在冈比亚按蚊中，AgOR2属于识别谱较窄的受体，对一部分气味产生反应，如：库蚊的产卵引诱剂，与人类汗液气味有30%相似性的吲哚(Meijerinketal.,2001)。Xia等(2008)发现，AgOR2不但在冈比亚按蚊成虫中表达，也在幼虫中表达，并参与2-甲酚、苯甲醛、吲哚和3-甲基吲哚的识别。有研究表明，致倦库蚊(Pelletieretal.,2010)和埃及伊蚊(Bohbotetal.,2011a)的OR2同源性较高，且都对吲哚产生反应。Scailo等(2012)从白纹伊蚊中克隆出第一个OR蛋白AalOR2，它对吲哚具有识别特性，该蛋白在幼虫头部和成蚊触角中表达，且与其他蚊虫的OR2同源性较高，说明OR2是蚊虫OR蛋白家族中的重要保守蛋白。

利用爪蟾卵母细胞表达冈比亚按蚊的OR(AgORs)，研究OR的改变带来的影响，结果表明OR不仅参与对抗、逃逸等行为，还参与蚊虫间的合作行为，暗示利用阻断OR途径，可控制蚊虫行为，开拓蚊虫防制的新思路(Bohbotetal.,2012)。

有关昆虫OR在神经系统信号转导中的作用，一般认为与哺乳动物的OR相同，是引起G偶联蛋白的β亚基或α亚基分离，通过改变离子通道，再引起动作电位。然而，有研究表明，利用基因敲除技术和膜片钳技术，发现昆虫的OR在信号传导中有其特殊性，即OR可以直接作为离子通道，而引起动作电位(Satoetal.,2008; Wicheretal.,2008)，这一发现丰富了人类认识动物信号转导的机制。

3 Or83b蛋白

OR基因在不同物种之间的同源性比较低，但有一个例外，那就是结构和功能高度保守的Or83b。它存在于几乎所有的昆虫中(Larssonetal.,2004; Jonesetal.,2005；Hallemetetal.,2006b; Xiaetal.,2006)，形成了一个特殊的Or83b 家族。这种在不同昆虫种间高度保守的 OR首先在果蝇基因组内发现，命名为DOR83b(Vosshalletal.,1999)。目前国内外已从双翅目、鳞翅目、膜翅目和鞘翅目等一些昆虫中发现这种基因(Hilletal.,2002; Kriegeretal.,2003; Xiaetal.,2006; 王妮娜等，2008; Jordanetal.,2009)。Or83b受体的另一个特征是在很多昆虫种类中，不同昆虫间氨基酸序列表现出约70%的同源性(Hilletal.,2002; Kriegeretal.,2003; Pittsetal.,2004)；对水稻害虫的研究发现，鳞翅目昆虫之间该基因的氨基酸序列相似性达94%，与致倦库蚊、冈比亚按蚊、埃及伊蚊相比，氨基酸序列相似性达到83%。

这种在各类昆虫中同源性高的、在进化中保留下来的OR，则可能在昆虫的嗅觉中起着独特和基础的作用。以果蝇、冈比亚按蚊和夜蛾等昆虫为实验材料，利用基因缺失突变体研究这几种昆虫气味受体的功能，将其Or83b 基因敲除后，突变体表现出嗅觉相关行为功能被严重削弱,而基因拯救后可以恢复正常(Larssonetal.,2004; Jonesetal.,2005)，表明Or83b 基因在昆虫嗅觉行为中具有重要作用(Wicheretal.,2008)。推测Or83b受体可能具有以下两种功能：一是在某个嗅觉感受神经元内它能够独立地结合特殊的配体，而和它共表达的其他OR则不能结合；二是它可能协助其他的OR基因，通过与其二聚体化来识别多样的气味物质(Larssonetal.,2004)。相对单独表达普通气味受体对气味分子的反应来说，在异源表达系统(Heterologous expression system)中共表达Or83b和普通气味受体后，对气味分子的识别反应显著增强，暗示Or83b 和普通气味受体形成的复合物可能是昆虫感受气味分子的真正受体(Nakagawaetal.，2005；Satoetal.，2008)。在不表达Or83b 受体家族的昆虫嗅觉感觉神经元中，也存在着多种受体以复合物的形式来完成对气味分子的感受功能(Kwonetal.，2007；Jonesetal.，2007；Bentonetal.，2009)。

另外，在研究冈比亚按蚊和果蝇对CO2的识别功能时，发现这种识别作用依赖于两种非Or83b 嗅觉受体，这两种受体在同一个神经元内共表达(Jonesetal.,2007)。这个实验结果说明昆虫神经—受体一对一表达很可能不是唯一的方式，也暗示昆虫嗅觉基因的表达调控更为复杂。

4 神经膜蛋白(Sensory neuron membrane protein,SNMP)

在鳞翅目昆虫嗅觉的研究中，从美洲野蚕Antheraeapolyphemus嗅觉感受神经元细胞膜提取物中纯化并克隆了一组SNMP，免疫学分析表明该蛋白只在嗅觉感受器纤毛、树突和神经元胞体中存在(Rogersetal.,1997)。序列分析表明它存在两个跨膜结构和一个较大的胞外环，类似于脊椎动物CD36家族的蛋白(一种类似于受体的膜蛋白)。CD36 家族是可以结合并且运输脂肪的跨膜蛋白,这类蛋白的功能是识别细菌的受体,在免疫系统中的组成部分(Vosshalletal.，2007)。SNMPs 的功能是运载气味分子，并且与嗅觉神经元细胞外的蛋白(如OBPs)、细胞膜上蛋白(Ors)以及胞质蛋白相互作用(Bentonetal.,2007)。Nichols 等(2008)从果蝇、冈比亚按蚊和埃及伊蚊等基因组中分别鉴定了12～14种SNMP/CD36类似物。Jin 等(2008)发现SNMP 对于果蝇的性信息素感受神经元感受性信息素cVA 是必要的，但是对于感受一般气味分子是不必要的。从组织分布推测SNMP可能是OR的一种。这些发现不仅有助于对OR功能特性的研究，更促进了对嗅觉途径的多样性的认识。

5 蚊虫驱避剂

目前仍占有一定市场的蚊虫驱避剂包括驱蚊胺(N,N-Diethyl-meta-toluamide,DEET)、羟哌酯(2-(2-羟乙基)-哌啶-1-碳酸-1-甲基异丙酯，KBR3023)、驱蚊酯(3-(N-正丁基乙酰胺基)-丙酸乙酯，IR3535)等。驱蚊胺是市场份额最大的驱蚊制品(Katzetal.,2008)，这种化合物的作用机理一直没有定论。一种说法是蚊虫不喜欢驱蚊胺的气味，另一种说法是它屏蔽蚊虫对其他化学气味的感知。研究发现，单独使用一些化学气味时，蚊虫的嗅觉系统会产生明显的神经反应，而这些化学气味与驱蚊胺一起使用时，蚊虫的神经反应显著减弱。说明驱蚊胺明显干扰蚊虫对其他化学小分子的感知能力，从而认为驱蚊胺屏蔽了蚊虫的嗅觉系统(Ditzenetal.,2008)，但也有报道称是由于驱蚊胺吸附了其他化学分子从而降低了它们发挥的量，才导致蚊虫的神经反应能力下降(Syedetal.,2008)。还有研究认为多种驱避剂的作用机制是抑制气味引发的OR介导的电流(Bohbotetal.，2011b)。

蚊虫的气味受体复合体包括一个特异性OR(ORx)和一个共受体(Orco)，细胞表面的神经传输和信号转换都需要Orco的参与。在埃及伊蚊体内，驱蚊胺是通过降低嗅觉感受神经(ORN)对于乳酸(Bernier,2002)的敏感阈值表现对已有气味的抑制作用。驱蚊胺选择性的抑制气味介导的OR8，而驱蚊酯、羟哌酯抑制OR2和OR8，3种驱避剂都不作用于共同受体Or83b(Ditzenetal.,2008; Bohbotetal.，2010; Bohbotetal.，2011b)。此外，驱蚊胺和驱蚊酯的识别位点并不在Orco上，且对Orco 无亲和力(Bohbotetal.，2012)。

2011年美国范德比尔特大学的研究人员在研究蚊虫嗅觉基本原理时发现一种化合物驱避剂，命名为VUAA1，这是一类新的嗅觉共受体激动剂，该类化合物具有比驱蚊胺强1 000倍的效果(Jonesetal.,2011)。与传统驱避剂不同，VUAA1的原理是直接激活Orco而不是单独激活某个ORx，它刺激所有的ORx-Orco连接。从理论上讲，VUAA1理论上可以激动所有表达Orco的ORNs，使蚊虫觉得这种“气味”是超负荷的存在，由此使蚊虫基本丧失嗅觉分辨力，辨别不出血液或者其他任何味道，也就无法搜寻到人体(向婧洁等，2013)。

6 展望

嗅觉系统在蚊虫的生命活动中起着关键作用，直接影响蚊虫感受外界环境和寻找宿主等行为。OR在嗅觉系统中占据十分重要的地位。近年来在OR结构、受体蛋白、表达及功能等方面进行了大量研究并取得进展，但是，有关蚊虫OR的作用机制、表达调控等诸多问题亟待探索。基于OR的蚊虫驱避剂研究初步表明，通过作用于OR可以形成对蚊虫嗅觉系统的干扰甚至阻断，也预示着以OR为基础研发高效广谱性蚊虫驱避剂成为可能。同时，蚊虫OR的研究，也为建立OR介导的蚊媒病传播阻断途径提供科学依据。